МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ИЗУЧЕНИЮ ЭМБРИОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ
ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ ПРИ ГИГИЕНИЧЕСКОМ
ОБОСНОВАНИИ ИХ ПДК В ВОДЕ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ

РАЗРАБОТАНЫ под руководством д.м.н. проф. Г.Н. Красовского, коллективом авторов: д.м.н. Г.Н. Красовским, к.м.н. З.И. Жолдаковой, д.м.н. Ю.А. Рахманиным, к.м.н. Т.И. Бонашевской, м.н.с. Т.Г. Ламентовой (Институт Общей и коммунальной гигиены им. А.Н. Сысина АМН СССР); д.м.н. А.А. Королевым, к.м.н. Б.Р. Витвицкой, м.н.с. Н.А. Зайцевым (1 Московский медицинский институт им. И.М. Сеченова); к.м.н. В.Н. Фоменко, к.м.н. И.В. Силантьевой (Институт гигиены труда и профзаболеваний АМН СССР); к.м.н. В.А. Рязановой (МНИИ гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана); д.м.н. Г.В. Селюжицким, к.м.н. В.В. Торопковым, к.м.н. Н.В. Волковой (Ленинградский санитарно-гигиенический медицинский институт); д.м.н. О.Г. Фроловой, к.м.н. Г.А. Шевелевой (Всесоюзный научно-исследовательский Центр по охране здоровья матери и ребенка МЗ СССР);

при участии: к.м.н. И.Н. Безкопыльного, д.м.н. Т.И. Искандарова, к.м.н. Д.Г. Красильникова, асс. Г.Ю. Объедковой, д.м.н. Е.В. Штанникова;

с использованием материалов следующих авторов: м.н.с. М.Ю. Антомонова, м.н.с. Л.Ф. Астаховой, к.м.н. М.Т. Абашидзе, к.б.н. Д.В. Баличиевой, асп. Р.М. Бектемировой, к.м.н. С.П. Варшавской, врача В.Д. Гостинского, к.м.н. В.В. Иванова, м.н.с. Г.И. Леонской, д.б.н. Р.В. Меркурьевой, к.м.н. Л.В. Марцонь, асп. В.П. Муллиной, д.м.н. В.Г. Надеенко, к.м.н. Э.Г. Плотко, к.м.н. Е.М. Трофимовича, д.м.н. Б.М. Штабского.

УТВЕРЖДЕНЫ Зам. главного государственного санитарного врача СССР В.Е. Ковшило 22 сентября 1983 г. № 2926-83

Методические указания предназначены для научно-исследовательских институтов гигиенического профиля, гигиенических кафедр медицинских ВУЗов, отделов и лабораторий по охране окружающей среды различных министерств и ведомств.

Введение

Экспериментальное изучение отдаленных последствий воздействия на организм химических веществ является существенным разделом токсиколого-гигиенической оценки химического соединения при регламентировании допустимого содержания в окружающей среде. В комплексе биологических эффектов, относящихся к отдаленным последствиям воздействия химических факторов, важное значение имеет изучение влияния химических соединений в пренатальный период развития организма. В настоящее время накоплены многочисленные данные о возможном влиянии химических веществ на процессы эмбриогенеза. Выявление реальной и потенциальной опасности вредного действия химических веществ на плод в условиях эксперимента на лабораторных животных требует унифицированных методических подходов для выбора тест-объектов, испытуемых доз, продолжительности опыта и количественной оценки результатов.

Настоящие Методические указания составлены на основании опыта работы 19 учреждений страны и обобщения данных литературы в целях разработки единых методических подходов к исследованию эмбриотоксического эффекта и оценке степени опасности этого вида воздействия при обосновании допустимого уровня содержания химических веществ в воде водоемов. Накопленный материал по экспериментальному изучению эмбриотоксического эффекта в разных научно-исследовательских лабораториях позволяет в настоящее время разработать единую схему постановки опыта с учетом квалификации персонала, степени трудоемкости и затраты времени в серийном токсикологическом эксперименте. При подготовке настоящих Указаний учитывалось место эмбриотоксических исследований в схеме этапного проведения исследований по гигиеническому регламентированию химических веществ в водной среде. Методические Указания призваны способствовать внедрению в практику гигиенического нормирования унифицированной схемы изучения эмбриотоксического эффекта и получению репрезентативных данных, необходимых для объективной сравнительной оценки результатов.

Основные понятия и термины

Эмбриотоксичность - потенциальная возможность вещества оказывать отрицательный эффект на потомство во время начального периода беременности, т.е. в период между зачатием и образованием эмбриона.

Тератоген - вещество, при воздействии которого на организм во время беременности возникают пороки развития и (или) отклонения в постнатальном развитии у потомства.

(Англо-русский глоссарий избранных терминов по профилактической токсикологии. Москва, 1981, Программа ООН по окружающей среде ЮНЕП).

1. Общие требования к проведению исследований по оценке эмбриотоксического и тератогенного действия химических веществ

1.1. Принципы изучения

При изучении эмбриотоксического действия химических веществ при их гигиеническом нормировании необходимо руководствоваться следующими принципами:

- возможность экспериментального воспроизведения эмбриотоксического эффекта на лабораторных животных;

- зависимость эффекта от дозы с установлением пороговости эмбриотоксического эффекта;

- этапность исследований при использовании традиционных и специальных методов оценки действия химического соединения на пренатальный период развития с установлением при этом обязательного и дополнительного объема исследований;

- приоритетность выбора методов оценки эмбриотоксического действия химических веществ на основе следующей классификации: обязательные и дополнительные методы исследования.

1.2. Выбор адекватной модели для изучения эмбриотоксического и тератогенного действия химических веществ

Наиболее удобной моделью являются белые беспородные крысы ввиду небольшой длительности беременности, высокой плодовитости (8 - 12 плодов), простоты определения первого дня беременности. Существенным является и тот факт, что крысы и человек имеют одинаковый гемохориальный тип плаценты; у крыс в отличие от мышей редко возникают спонтанные аномалии развития.

2. Изучение эмбриотоксического действия химических веществ

Изучение эмбриотоксического эффекта требует специальной серии опытов с использованием достаточно большого количества животных. В каждом конкретном случае определяется целесообразность и объем исследований. Эти исследования необходимы:

- для новых или недостаточно изученных классов химических соединений;

- для соединений, оказывающих влияние на функцию гонад, для мутагенов и канцерогенов или близких к ним по химическому строению соединений;

- для химических соединений, характеризующихся по данным литературы легким и быстрым проникновением через плацентарный барьер;

- при наличии сведений об эмбриотоксичности вещества при обосновании ПДК его в других областях гигиенического нормирования.

В настоящее время существуют расширенные списки веществ, обладающих эмбриоторопным действием, согласно которому целый ряд веществ обладают выраженными эмбриотоксическими свойствами и относятся к различным группам химических соединений: химические канцерогены, углеводороды, соединения серы, хлорированные углеводороды, амиды, амины, имины, тяжелые металлы, хлор- и фосфорорганические соединения; лекарственные препараты: гормональные, антибиотики, снотворные, седативные, транквилизаторы, противоопухолевые препараты.

2.1. Этапы изучения эмбриотоксического действия химических веществ

Эксперименты по изучению эмбриотоксичности не проводятся, если достаточно твердо установлено экспериментальным или расчетным методом, что изучаемое вещество относится к IV классу опасности и лимитирующим признакам вредности при обосновании ПДК будет органолептический или общесанитарный показатель.

Эмбриотоксические исследования следует проводить для веществ I - III классов опасности в самостоятельных опытах на II-м этапе схемы обоснования ПДК. Если не выявлено эмбриотоксическое действие в дозах, превышающих более чем на порядок общетоксический эффект, или в результате этого опыта, установлено, что пороговая концентрация по эмбриотоксическому действию оказалась выше пороговой по общетоксическому действию в 10 и более раз, то данный раздел исследований можно считать завершенным. При совпадении пороговых доз по одному и другому эффекту необходимо проведение углубленных исследований по изучению специфичности эмбриотоксического эффекта с применением дополнительных методов и испытания доз на 1 - 2 порядка ниже максимально недействующей дозы, установленной в хроническом опыте по общетоксическому действию. Если в последующем установлено, что эмбриотоксический эффект является ведущим при обосновании ПДК, то необходимы специальные исследования с введением вещества в критические и чувствительные периоды беременности и изучения функционального состояния потомства до периода половой зрелости.

2.2. Обязательные методы оценки эмбриотоксического действия химических веществ

2.2.1. Методика постановки эксперимента

В опытах используются клинически здоровые интактные животные (половозрелые самки и самцы) в репродуктивном возрасте, все животных 180 - 240 г Количество животных должно быть не менее 10 животных в каждой опытной группе, в контрольной группе и в группе сравнения. Группа сравнения позволяет обнаружить отличия в поражении беременного и небеременного организма. При отборе для опыта крыс-самок в ряде случаев рекомендуется изучение у них эстрального цикла по методике И.П. Западнюк (1962) - окрашивание вагинальных мазков метиленовой синью с последующей оценкой состояния цикла по 4-м стадиям эструса в зависимости от элементов мазков. Спаривание производится в конце рабочего дня, при этом самцы подсаживаются к самкам в соотношении 1:2 или 1:3. Первый день беременности устанавливается на основании обнаружения у нормально циклирующих самок сперматозоидов в вагинальном мазке. Мазок из влагалища крысы берут каждый раз новым слегка увлажненным тонкослойным ватным тампоном на заостренной спичке или стеклянной глазной палочкой, которую промывают после каждого взятия мазков в двух стаканчиках с водой. Мазок делают на обезжиренном предметном стекле, тщательно растирая содержимое тампона в капле обычной или дистиллированной воды. Препарат тотчас микроскопируют неокрашенным под малым увеличением. При обнаружении сперматозоидов производят маркировку, определяют массу тела крысы, отсаживают ее в отдельную клетку и начинают отсчет срока беременности. С 1-го по 21-й день беременности проводят пероральное введение изучаемого вещества в дозе, соответствующей задаче эксперимента, определяют прирост массы тела беременных животных на 1, 8, 14 и 21 сутки беременности. На 21-й день беременности крыс умерщвляют для последующих исследований согласно "Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных" (Приказ № 755 МЗ СССР от 12.07.77). При выявлении тератогенного эффекта желательно провести новую серию опыта с введением вещества в критические периоды эмбриогенеза с учетом органотропности изучаемого химического соединения и сроков закладки соответствующих органов и систем. В этой серии предусматривается проведение однократных затравок в периоды наибольшей чувствительности морфогенетических систем к определенному токсическому агенту, последующий забой животных проводят на 21-е сутки.

2.2.2. Методика взятия эмбрионального материала

Перед умерщвлением определяют массу тела беременной крысы, затем производится вскрытие. Необходимый инструментарий для этого: большие и малые ножницы, анатомический и глазной пинцеты, линейка, измеритель, весы, чашки Петри с увлажненной фильтровальной бумагой.

При вскрытии беременных крыс следует избегать условий, приводящих к механическим повреждениям плодов. После вскрытия осторожными движениями проводят пальпаторное обследование рогов матки с подсчетом количества плодов и мест резорбций. Выделяют правый и левый яичники, тщательно очищают их от жировой ткани и помещают на увлажненную фильтровальную бумагу в чашке Петри, при этом в рабочем журнале заранее расчерчивают сетку для регистрации данных по левому и правому яичнику, что важно для точного определения показателя общей эмбриональной смертности при сопоставлении количества желтых тел беременности в яичнике и плодов в соответствующем роге матки. Осторожно вскрывают рога матки по наружному краю и освобождают плоды от околоплодных оболочек и отделяют от плаценты, пережимая при этом пуповину на 2 - 3 сек пинцетом. Подсчитывают число живых, мертвых, резорбированных плодов, количество мест имплантаций. Живые плоды реагируют на механическое воздействие. На лотке в последовательном порядке соответственно из левого и правого рогов матки располагают плоды и плаценты. Затем производят определение краниокаудального размера плодов, массу тела плодов и плаценты. Данные при вскрытии каждой беременной крысы записываются в протокол (схема в приложении).

Для выявления патологии внутренних органов две трети количества плодов фиксируют в растворе Буэна, остальную часть плодов фиксируют в 96° спирте для изучения стадий окостенения скелета. Количество желтых тел беременности в яичниках, подсчитывают с помощью лупы и тонкой иглы; резорбции определяют визуально. Резорбированные зародыши имеют вид точечных образований, симметрично расположенных по наружным краям рогов матки; в случае гибели эмбрионов на более поздних стадиях - резорбции имеют вид округлых гомогенных тел диаметром 2,5 - 3 мм.

2.2.3. Учет показателей эмбриотоксического эффекта

Первичной экспериментальной единицей наблюдения для статистического расчета является один помет, т.е. количество беременных крыс на одну испытанную дозу, с учетом и последующей оценкой информации внутри его. На основании результатов вскрытия определяют следующие показатели по формулам А.М. Малашенко, М.К. Егоровой (1967), lyon М.F. et al (1974).

1) Общая эмбриональная смертность (%)

(В - А) : В × 100

2) Гибель эмбрионов до имплантации (%)

[В - (А + Б)] : В × 100

3) Гибель эмбрионов после имплантации (%)

Б : (А + Б) × 100

4) Показатель внутриутробной выживаемости (%)

(А : В) × 100

5) Показатель индуцированной гибели эмбрионов (%)

{I - [(A : B_опыт) : (A : B_контр)]} × 100,

где А - число живых эмбрионов;

Б - число мертвых эмбрионов и число резорбций;

В - количество желтых тел беременности.

6) Плодово-плацентарный индекс (ppi):

масса плаценты : масса плода - показатель полноценности функционирования фето-плацентарного комплекса и нарушения развития плода и плаценты.

7) Количество живых плодов на одну самку.

8) Индекс оплодотворения (%):

(кол-во забеременевших самок) : (кол-во оплодотворенных) × 100 самок

9) Определение показателя соотношения количества самок и самцов в помете проводится только в тех случаях, когда опытная группа чрезвычайно велика (не менее 1000 животных). Анализ эмбрионального материала проводится по показателям, представленным в таблице № 1 (в приложении).

Одновременно при проведении этих исследований визуально оценивается возможный тератогенный эффект. Если даже при действии максимально испытанных доз тератогенный эффект макроскопически не обнаруживается, дополнительные исследования не проводятся.

При обнаружении признаков тератогенного действия или при вариантах, отмеченных в пункте 2.1., проводятся исследования с целью изучения тератогенного эффекта.

3. Изучение тератогенного действия

К тератогенному эффекту относят все гистоморфологические дефекты развития, биохимические, функциональные и другие нарушения функции органов и систем, проявляющиеся в постнатальном периоде развития (И.В. Саноцкий, 1979). По классификации ВОЗ, тератогенность является видом эмбрио-фетальной токсичности и характеризуется постоянными структурными аномалиями, обусловленными пренатальной экспозицией токсических соединений. Любые нарушения роста, веса, выживаемости, а также отклонения в эмбриогенезе следует рассматривать как аномалии развития, которые могут быть общими, локальными, функциональными. Повреждение плода может быть в целом, отдельных частей или органов, или нарушения функции.

Аномалии могут быть общими (отставание в весе, в развитии, отеки, расширение сосудистой сети, гематомы точечные и обширные и другие). Внешний осмотр плодов проводят с помощью лупы от головы к хвосту. Осмотр черепа в профиль и в анфас дает возможность определить водянку мозга. При осмотре глаз отмечают наличие их, размеры, расположение. Отмечают комбинированные дефекты черепа и мозга; морду плода следует осматривать в анфас для обнаружения надрезов или трещин, указывающих на расщелину неба, нижней челюсти, лицевых костей. Расщелину неба, если она большая, можно увидеть, вставив в рот глазной пинцет и слегка раздвинув челюсти. Незаконченная форма расщелины неба может быть обнаружена только при микроанатомическом сечении. Аномалии внешнего уха могут проявляться отклонениями в размере, форме и положении. Аномалии конечностей обычно проявляются необычным их размером или положением пальцев. Аномалии туловища могут проявляться в виде пупочной грыжи, незаращении передней стенки и других отклонений. Если отсутствует несколько позвонков выше хвоста, то туловище выглядит короче и закругленнее обычного. Довольно часто отмечаются аномалии хвостовых позвонков, в результате чего хвост либо отсутствует, либо короткий, свернутый кольцом или изогнут под углом. Дефектом позвоночника является также заращение анального отверстия.

3.1. Проведение исследований для выявления патологии внутренних органов

21-дневные плоды фиксируют в жидкости Буэна, состоящей из перенасыщенного раствора пикриновой кислоты, 40 % формалина и ледяной уксусной кислоты в соотношении 15:5:1 соответственно. Через 7 дней фиксированные эмбрионы переносят в 70° спирт, где они могут сохраняться в течение длительного периода времени. Качество эмбрионального материала при выполнении этих исследований во многом определяется объемом фиксатора, рекомендуется брать 25 мл жидкости Буэна на один плод. Перед проведением исследований для выявления внутренней патологии плоды вынимают из банки, в течение 10 минут отмачивают в воде для удаления раздражающих паров фиксатора и затем подвергают микроанатомическому сечению. Для целей исследования плоды разрезают бритвой по 9-ти сагитальным срезам, которые тщательно изучают с помощью бинокулярной лупы (Вильсон, 1965 в модификации А.П. Дыбана, 1967).

Уровни срезов и исследование внутренних органов плода.

1 - проводят параллельно нижней челюсти с целью отделения головы от туловища;

2 - проводят перпендикулярно нижней челюсти сразу за вибриссами. Изучают состояние нижней челюсти, переднего отдела твердого неба и носовой полости;

3 - проводят через середину глазных яблок. Изучают состояние глаз и обонятельных луковиц;

4 - проводят между 3-м и 5-м срезами. Изучают состояние головного мозга: коры больших полушарий, боковых и третьего желудочков;

5 - проводят сразу за ушами. Изучают состояние четвертого желудочка мозга 4-й и 5-й срезы позволяют диагностировать водянку головного мозга;

6 - проводят тотчас впереди передних конечностей. Изучают состояние пищевода, трахеи, спинного мозга и сосудов;

7 - проводят за передними конечностями. Изучают органы грудной полости: состояние сердца, легких, бронхов, пищевода, спинного мозга;

8 - проводят по середине между 7-м срезом и пупочным кольцом через печень. После осмотра печень осторожно извлекают и осматривают диафрагму;

9 - проводят немного ниже пупочного кольца. После осторожного удаления кишечника и печени можно изучать состояние почек, мочеточников, мочевого пузыря, прямой кишки и половых органов.

Для выявления аномалий скелета плода и процесса окостенения широкое применение находит метод Даусона. Плоды фиксируют в 96° спирте в течение 10 - 15 дней. Затем у каждого плода удаляют печень и кишечник, после чего заливают 1 % раствором KOH на 1 - 2 дня до просветления тканей и появления видимого скелета, для лучшего просветления тканей плода заливают раствором KOH из расчета 25 мл на один плод. После этого плоды промывают 3 - 4 раза водопроводной водой и заливают на 3 - 5 суток ализариновым красителем, который готовят по прописи А.П. Дыбан (1970): KOH - 10 г, глицерин - 150 мл, дистиллированная вода - 800 мл (раствор "Б") и добавляют несколько капель 1 %-го водного раствора красного ализарина (раствор "А") до образования сиреневого оттенка. После прокрашивания скелета в сиреневый цвет плоды промывают в растворе "Б" до полного просветления раствора и тканей плодов с ежедневной проводкой по схеме:

Благодаря подобной схеме содержание глицерина в растворе доводят до 100 %. После этого к нему добавляют 2 - 3 капли формалина, что обеспечивает сохранность плодов в таком растворе в течение длительного времени. Для удобства хранения плодов рекомендуется 1 - 2 плода погружать в пенициллиновые пузырьки и добавлять на этот объем 1 каплю формалина или один кристаллик тимола.

Целесообразно использование метода Даусона в модификации T.H. Ingalls (1952) для быстрого получения просветленного и окрашенного образца, пригодного к немедленному исследованию. Эмбрионы, хранившиеся в 70° спирте, помешают в 1 % раствор КОН на 48 часов; спустя первые 24 часа, когда кости становятся видны через прозрачные ткани, на каждые 10 см³ KOH добавляют одну каплю 0,5 %-го раствора красного ализарина. Затем плоды промывают в проточной воде и анализируют.

3.2. Регистрация результатов и классификация аномалий развития

Все срезы просматривают под бинокулярной лупой и регистрируют данные о наличии внешних и внутренних аномалий развития по схеме, предложенной Отделом эмбриологии Института экспериментальной медицины АМН СССР.

При наличии случаев с внешними аномалиями развития проводится их регистрация согласно классификации ВНИИГИНТОКС, 1969. Таблица с перечнем наиболее часто обнаруживаемых аномалий развития внутренних органов представлена в приложении.

4. Дополнительные методы исследования

Данный этап исследований проводится только при необходимости более глубокого и всестороннего изучения эмбриотоксического и тератогенного действия вещества. В этом разделе исследований набор методов расширяется в соответствии с конкретными задачами, связанными с особенностями действия вещества. В качестве дополнительных методов могут быть рекомендованы следующие:

4.1. Определение испытуемого вещества в крови и тканях внутренних органов матери, плода и в плаценте с целью выявления степени проницаемости плацентарного барьера. Показателями проникновения вещества через плаценту является непосредственное определение вещества в плаценте и в целом эмбрионе, либо в органах и тканях плода. Определяют уровень содержания вещества в плаценте, эмбрионе и в органах материнского организма, что позволяет изучить вопросы кинетики изучаемого соединения в организме беременной крысы. Конкретный выбор внутренних органов для определения содержания вещества основывается на данных информации о критических органах, в которых преимущественно накапливается изучаемое вещество. При необходимости изучения механизма действия вещества и определения содержания его в органах плода следует исследовать одноименные органы беременной крысы и плода, поскольку накопленные данные свидетельствуют об одноименном поражении систем: "орган к органу" в период эмбриогенеза. Выбор методов определения и подготовки биоматериала для исследований диктуется особенностями существующих методов идентификации изучаемых веществ. Оптимальным является применение высокочувствительных методов, позволяющих обнаружить даже незначительные количества вещества.

4.2. Для изучения проницаемости плацентарного барьера можно использовать методы, основанные на определении величин pH и содержания Р₃₂ в крови матери, тканях плода и плаценте. Радиоактивный фосфор в количестве 20 микрокюри вводят беременной крысе внутрибрюшинно через 30 минут после воздействия химическим веществом. Проводят измерение радиоактивности крови матери, плода и околоплодных вод. Определения рН проводят в динамике через 30, 60 минут и через 24 часа после введения препарата. Для опосредованного изучения проницаемости плаценты можно применить метод внутривенного введения в хвостовую вену беременной самке нейтрального красителя, после чего регистрируется количество краски, прошедшей через плаценту.

4.3. Структурно-функциональный анализ печени, почек, эндокринных желез, коры больших полушарий, плаценты и амниотической оболочки. При этом морфологическими критериями эмбриотоксического действия являются: нарушение степени клеточно-тканевой дифференцировки, появление геморрагических фокусов, деструктивно-дистрофические процессы в мишеневых системах. Критериями ранних нарушений механизма гомеостаза организма антенатального периода развития являются изменения активности оксиредуктаз в тканях внутренних органов плода и в плаценте. Кроме того, для оценки функционального состояния плаценты целесообразно определение показателей белоксинтетической активности: содержание PHK, SH-групп, суммарного белка. Из гистохимических показателей можно использовать методы изучения аргирофильных волокон, реакции на кислые гликозаминогликаны. Морфометрическая оценка гистологического строения внутренних органов плода и плаценты проводится в соответствии с общепринятыми методическими подходами при проведении подобного рода исследований.

4.4. При проведении исследований по расширенной схеме ведут наблюдения за развитием потомства 1-го поколения. С этой целью половину беременных самок оставляют до наступления естественных родов и в дальнейшем наблюдают за развитием потомства. Обследование потомства в постнатальный период должно охватывать все функции организма. Большое значение придается исследованию функции сердечно-сосудистой и нервной системы. Достоверными показателями могут служить изменения биохимических и физиологических параметров, используемых для оценки состояния органов и систем подопытных животных. Определяют активность ферментов, величину суммационно-порогового показателя, норковый рефлекс, выработку условных рефлексов, поведенческие реакции и определение мышечной силы. Особое внимание должно быть обращено на состояние той системы, которая избирательно поражается в материнском организме и является ведущим показателем в патогенезе интоксикации материнского организма. В постнатальном периоде регистрируют гибель, прирост массы тела в динамике через 3 - 7 - 14 - 21 - 30 дней после рождения. По достижении 2-месячного возраста крысят обследуют с использованием интегральных и специфических показателей. В ряде случаев для выявления скрытого действия изучаемого вещества применяют некоторые функциональные нагрузки: гексеналовый сон, алкогольная нагрузка, работоспособность, нагрузка изучаемым веществом.

4.5. Изучение состояния ферментных систем внутриклеточных органелл. Целесообразно определение активности лизосомальных, митохондриальных и микросомальных ферментов в биологических субстратах материнского организма (сыворотка крови и моча) и во внутренних органах самки и плода. Чувствительными тестами является определение активности галактозидазы, N-ацетил-β-Д-глюкозаминидазы, кислой фосфатазы, малатдегидрогеназы, ацетилэстеразы, инозин-5-дифосфатазы, уровня содержания нейраминовой кислоты в ткани головного мозга эмбрионов. Определение активности ферментов в постнатальном периоде развития имеет значение для установления эмбриотоксического эффекта химического соединения.

4.6. Висцеральное исследование плода в день забоя, что позволяет провести предварительную оценку наличия и степени выраженности тератогенного эффекта изучаемого вещества и выявить преимущественное действие на сердечно-сосудистую систему (Staples E., США, 1974). Этот метод подробно изложен в "Методике висцерального исследования плода лабораторных животных при экспериментах по оценке тератогенной активности химических веществ" ("Методические рекомендации, М., 1980).

4.7. Определение, объема околоплодной жидкости у крыс прямым методом на 20-й день беременности. По данным Gulienetti R. (1962), у контрольных крыс объем околоплодной жидкости составляет, в среднем, 0,56 мл (n = 101).

4.8. Для характеристики функционального состояния сердечно-сосудистой системы новорожденных крысят изучают становление у них сердечного ритма в процессе индивидуального развития, изменение биоэлектрической активности сердца, а также ряда показателей ЭКГ со дня рождения и на 30-е сутки постнатальной жизни.

4.9. Для характеристики белкового обмена в клетках печени новорожденных и их матерей используют гистоавторадиографические исследования с 1 по 30 день постнатальной жизни. Для этого применяют метионин, меченный по S₃₅, который вводят за 2 часа до декапитации животных, доза равна 0,5 микрокюри на 1 г массы тела. Количественный анализ включения S₃₅ проводят на гистоавтографах при 5-суточной экспозиции с помощью сетки окулярмикрометра и последующим вычислением среднего количества треков на один квадрат (100μ₂).

4.10. Для характеристики углеводного обмена в клетках печени новорожденных с 1 по 30 день постнатального периода развития и их матерей проводят цитофотометрическое определение количества гликогена в клетках печени на микроспектрофотометре МУФ-5.

4.11. Для изучения синтеза ДНК и митотической активности клеток печени новорожденных крысят с 1 по 30 день и их матерей можно рекомендовать гистоавторадиографический метод. В качестве индикатора синтеза ДНК используют Н₃-тимидин, который вводят внутрибрюшинно за 1 час до декапитации в дозе 0,5 микрокюри на 1 г массы тела. На автографах с Н₃-тимидином, полученных после 25 - 30-дневной экспозиции определяют индекс мечения ядер печеночных и купферовских клеток в расчете на 2000 - 4000 клеток. Помимо этого, на обычных препаратах подсчитывают число митозов в гепатоцитах в расчете на 4000 клеток и вычисляют митотический коэффициент в промиллях.

5. Оценка результатов исследований

Результаты исследований должны подвергаться обязательной статистической обработке. Материалы экспериментов следует анализировать с использованием различных статистических методов. При рассмотрении полученных данных необходимо определить вид эмпирического распределения и в зависимости от характера полученного распределения использовать соответствующие критерии статистической обработки: критерий "t", по Стьюденту-Фишеру, критерий χ², методы корреляционного, регрессионного и дисперсионного анализа, критерий знаков Уайта, Вилкоксона. Для качественных показателей эксперимента, представленных в альтернативной форме - живой, мертвый, есть или нет уродства, и выраженных в процентах, рекомендуется использовать информационные критерии Культеха, критерии Фишера с использованием дву- и четырехпольной таблиц.

Конечной целью проводимых экспериментальных исследований является определение количественных уровней пороговых и максимально недействующих концентраций для обоснования предельно допустимой концентрации химического вещества в воде водных объектов.

При регламентировании химических соединений целесообразно ориентироваться на зону специфического действия (Z_spec.), являющуюся мерой избирательности поражения при действии химического агента на процессы развития эмбриона и плода. При изучении действия химических соединений на эмброгенез Z_spec. вычисляется по соотношению порогов общетоксического действия вещества на материнский организм, установленного непосредственно на беременных самках, к пороговой концентрации, установленной по действию на развитие плода. Таким образом, величина зоны специфического действия определяется по соотношению общетоксического и специфического эффектов. Исходя из величины Z_spec., можно использовать классификацию потенциальной опасности влияния химических соединений на эмбриофетогенез (табл. № 2).

Классификация потенциальной опасности химических веществ по эмбриотоксическому эффекту

Данную классификацию можно использовать для уточнения классификации опасности химического вещества и при обосновании ПДК химических соединений в водной среде.

6. Общие рекомендации по проведению эпидемиологического изучения влияния химических загрязнений воды на репродуктивную функцию женского организма

Наряду с экспериментальными исследованиями эмбриотоксического воздействия химических веществ, важное значение приобретает изучение репродуктивной функции женщин путем ретроспективной статистической разработки данных женских консультаций и родильных домов. При оценке репродуктивной функции женщин учитывается:

- состояние менструальной функции;

- наличие первичного и вторичного бесплодия;

- уменьшение количества беременностей и увеличение самопроизвольных выкидышей;

- характер течения беременности, родов, послеродового периода;

- состояние здоровья в период беременности;

- мертворождения;

- развитие плода и состояние новорожденного.

В соответствии с приказом МЗ СССР № 1030 от 4.10.80 основными документами для этих целей являются:

- медицинская карта амбулаторного больного - форма № 025/у;

- контрольная карта диспансерного наблюдения - форма № 030/у;

- индивидуальная карта беременной и родильницы - форма № 111;

- медицинская карта стационарного больного - форма № 003/у;

- история родов - форма № 096/у;

- история развития новорожденного - форма № 097/у.

По данным женской консультации (форма № 025/у) можно получить сведения о наиболее информативных показателях состояния менструальной функции (наступление первых менструаций, частота, длительность, цикличность, менограмма) и о наиболее приоритетных показателях состояния гормональной функции яичников (базальная температура, "симптом зрачка", симптом "папоротника", данные цитологического исследования влагалищных мазков, данные диагностического выскабливания полости матки).

При анализе данных женской консультации и акушерско-гинекологического стационара (формы соответственно № 025/у и № 003/у) обращается особое внимание на следующие нозологические формы: воспаления шейки матки и придатков, кольпиты, эрозии шейки матки, доброкачественные опухоли матки и придатков, бесплодие.

По данным контрольной карты диспансерного наблюдения (форма № 030/у), индивидуальной карты беременной и родильницы (форма № 111), истории родов (форма № 096/у) и истории развития новорожденного (форма № 097/у) получают данные о состоянии детородной функции женщин (характер течения беременности, родов и послеродового периода). Особое внимание при этом обращается на нарушения или осложнения течения беременности (количество токсикозов 1-й и 2-й половины, угрожающее прерывание беременности, пролонгированное течение, осложнения родовой деятельности, количество беременностей и родов, количество самопроизвольных выкидышей, искусственные прерывания беременности).

При анализе истории развития новорожденного (форма № 097/у) получают информацию о наиболее приоритетных показателях состояния ребенка при рождении (масса тела, длина тела, окружность груди, наличие аномалий развития, рождение в асфиксии, снижение массы тела и ее восстановление, время пребывания детей в стационаре (роддоме).

Проведение подобных исследований требует достаточной статистической группы с соответствующей контрольной группой сравнения. Подбор групп сравнения должен осуществляться при полной идентичности и однородности "копий-пар" женщин по возрастным, социально-экономическим, социально-бытовым, алиментарным и другим показателям, но не подвергавшихся воздействию химических веществ в течение своей жизни. В приложении представлена анкета изучения репродуктивной функции женщин по данным женской консультации и родильного дома.

7. Приложение

Протокол вскрытия беременных крыс по теме:

ЛИТЕРАТУРА

1. Волкова Н.В., Селюжицкий Г.В. Сб. докладов научно-практич. конф., Волгоград, 1979.

2. Гофмеклер В.А. Ж. "Гигиена и санитария", 1969, № 8, 47 - 50.

3. Дыбан А.П. Архив анатомии, гистологии и эмбриологии, 1967, 1, 8, 75 - 84.

4. Дыбан А.П., Баранов В.С., Акимова И.М. Архив анатомии, гистологии и эмбриологии, 1970, 59, 10, 89 - 100.

5. Дыбан А.П. Кн. Материалы 2-го советско-американского симпозиума по проблеме "Гигиена окружающей среды", М., 1977, 77 - 81.

6. Динерман А.А., Варшавская С.П. Научн. обзор "Отдаленные последствия биологического действия некоторых химических веществ, загрязняющих окружающую среду", М., 1975, 39 - 41.

7. Саноцкий И.В., Фоменко В.Н. Отдаленные последствия влияния химических соединений на организм. М., "Медицина", 1979, 96 - 99.

8. Силантьева И.В. Токсикология новых промышленных веществ, вып. 13, М., 1972, 70 - 76.

9. Меркурьева Р.В., Астахова Л.Ф., Бектемирова Р.М. Вопросы медицинской химии, 1983, 4, 57 - 59.

10. Сальникова Л.В. Научный обзор ''Отдаленные последствия влияния на человека химич. вещ-в, применяемых в промышленности и сельском хоз-ве", М., 1969, 47 - 53.

11. Шицкова А.П., Елизарова О.Н., Жидкова Л.В. Методы гигиенической и токсикологической оценки биологического действия пестицидов", М., "Медицина", 1977, 85 - 93.

12. Западнюк И.П., Западнюк В.И. Лабораторные животные, их разведение, содержание и использование в эксперименте. М, 1962, 256 - 258.

СОДЕРЖАНИЕ