4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение концентраций штаммов
микроорганизмов в атмосферном воздухе
населенных мест

Сборник методических указаний

МУК 4.2.3249-14

МУК 4.2.3251-14

МУК 4.2.3253-14

МУК 4.2.3255-14

МУК 4.2.3257-14

Выпуск 1

Москва 2015

1. Разработаны и подготовлены ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6.11.2014 № 2).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 30 декабря 2014 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

Сборник методических указаний «Измерение концентраций штаммов микроорганизмов в атмосферном воздухе населенных мест» (выпуск 1) разработан с целью обеспечения контроля соответствия фактических концентраций микроорганизмов их предельно допустимым концентрациям (ПДК), что является обязательным при осуществлении санитарно-эпидемиологического контроля.

Включенные в данный сборник методические указания по контролю биотехнологических штаммов в атмосферном воздухе населенных мест разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методики выполнены с использованием современных и адекватных микробиологических методов исследования и позволяют контролировать концентрации биотехнологических штаммов микроорганизмов на уровне и ниже их ПДК в атмосферном воздухе населенных мест, установленных в гигиенических нормативах.

Методические указания по измерению концентраций штаммов микроорганизмов в атмосферном воздухе населенных мест предназначены для лабораторий центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, санитарно-микробиологических лабораторий промышленных предприятий, а также для научно-исследовательских институтов и других заинтересованных министерств и ведомств, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований, для осуществления контроля за содержанием штаммов в атмосферном воздухе населенных мест.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение концентрации
Rhodococcus jialingiae 1kp ВКПМ Ас-1957
в атмосферном воздухе населенных мест

1. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Rhodococcus jialingiae 1kp ВКПМ Ас-1957 в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м³ воздуха.

1.2. Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Биологическая характеристика штамма Rhodococcus
jialingiae 1kp ВКПМ Ас-1957 и его гигиенический норматив
в атмосферном воздухе населенных мест

Штамм бактерии выделен из нефтезагрязненных торфяных почв и верховых торфяников Тюменской области, природный изолят. Отобран по способности эффективно снижать содержание нефти в загрязненной ею воде, песке и почвах. Растет на средах с гексадеканом и нефтью в качестве единственных источников углерода.

Первоначально штамм был изолирован из ила очистных сооружений китайским микробиологом Цзя-Линг Ванг, в честь которого был и назван. Является компонентом биопрепарата по биоремедиации почв, грунтов, водоемов и стоков от нефти и нефтепродуктов.

По анализу секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, выделенный штамм является Rhodococcus jialingiae (99 %). Аэроб. Способен к росту на средах, содержащих источники углерода. Хорошо утилизирует фруктозу, сорбит, маннит, инозит, слабее глюкозу, сахарозу, мальтозу, сукцинат, цитрат и бензоат, активно разлагает тирозин.

По систематическому положению относится к группе нокардиоформных актиномицетов к подгруппе бактерий, содержащих миколовые кислоты.

Макроскопически колонии микроорганизма круглые, непрозрачные, слизистые, блестящие, плоские, вершина приподнята, края ровные, окраска розовато-кремовая.

При микроскопическом исследовании культура представлена кокковидными клетками, иногда палочками, неравномерными по толщине грамположительными клетками, споры отсутствуют. В молодой культуре палочки проявляют склонность к ветвлению (образование примитивного мицелия), диаметр клеток 0,6 - 0,8 мкм, длина в среднем составляет 4 - 8 мкм, в случае примитивного мицелия - до 10 - 12 мкм. Цикл развития хорошо выражен, на ранних стадиях (20 - 24 ч) наблюдается элементарное ветвление, в дальнейшем (3 - 4 сут.) происходит распад длинных клеток на палочковидные и кокковидные элементы.

Мезофил. Рост очень хороший - через 24 ч при 25 - 28 °С образует колонии на глюкозо-пептонном агаре. Выдерживает концентрации хлорида натрия до 1 % и немного более.

Штамм растет на жидких и агаризованных средах - глюкозо-пептонном агаре (ГПА), мясо-пептонном агаре (МПА), АГВ-среде, картофельном агаре (КА). Можно культивировать в LB-бульоне, на LB-aгаре и готовой глюкозо-пептонной среде (ГПС).

Штамм R. jialingiae 1kp депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ Ас-1957.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 5000 кл/м³.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнения измерений количества бактерий в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из атмосферного воздуха населенных мест бактерий на глюкозо-пептонный агар и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства
и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, реактивы и питательные среды.

5.2. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.2. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.3. Реактивы и питательные среды

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штамма в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают следующие требования.

6.1. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

6.2. СП 1.3.2518-09. Дополнения и изменения 1 к СП 1.3.2322-08.

6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.4. Элекгробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

- температура воздуха (20 ± 5 ) °С;

- атмосферное давление (760 ± 20) мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80 %.

9. Приготовление питательных сред

9.1. Глюкозо-пептонный агар (ГПА)

Для приготовления используют сухую готовую глюкозо-пептонную среду: 50,0 г порошка размешивают в 1000 мл дистиллированной воды. Можно использовать отдельные компоненты среды следующего состава: пептон - 20,0 г; глюкоза - 10,0 г; хлорид натрия - 5,0 г; агар-агар - 15,0 г. Сухие компоненты растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.

Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 - 500 см³ и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

9.2. Глюкозо-пептонный агар с 1 %-м хлоридом натрия

Приготовление среды проводят аналогично п. 9.1, добавляя 10 г/л хлорида натрия, т.е. в 2 раза больше рекомендованного количества.

Готовые среды хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С в течение 14 дней, не более.

10. Проведение измерения

10.1. Отбор проб воздуха

Отбор проб воздуха проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри с питательной средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро вынимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

10.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа проб воздуха стерильную агаризованную среду (ГПА) расплавляют, остужают до 50 - 60 °С и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °С не менее, чем на 18 ч. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 - 8) °С не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (26 ± 2) °С. Через 1 - 2 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам (прямой метод).

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред (МУК 4.2.2316-08). Для этого эталонный музейный штамм Rhodococcus jialingiae 1kp ВКПМ Ас-1957 высевается на 2 - 3 чашки используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

При выполнении анализа воздуха дополнительным (физиологическим) методом пробы воздуха отбирают на чашки Петри с ГПА, содержащей хлорид натрия в концентрации 1 %. Дальнейшее выполнение анализа аналогично прямому методу, приведенному выше.

11. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток производят по формуле:

К - концентрация штамма в воздухе, кл/м³;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

Т - время аспирации, мин.

12. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по следующей форме.