4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Организация и проведение лабораторных
исследований на иерсиниозы
на территориальном, региональном и
федеральном уровнях

Методические указания
МУК 4.2.3019-12

Москва 2012

1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е.Б. Ежлова, Ю.В. Демина, Н.В. Шеенков); Федеральным бюджетным учреждением науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Роспотребнадзора (Г.Я. Ценева, Е.А. Воскресенская, Г.И. Кокорина. Е.А. Богумильчик); Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора (М.В. Чеснокова, С.В. Балахонов, В.Т. Климов, К.А. Тирских, М.Б. Черепанова); Федеральным бюджетным учреждением здравоохранения «Центр гигиены и эпидемиологии в Новосибирской области» (Т.В. Каримова. О.В. Якунина).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 18 июня 2012 г.

3. Введены в действие с момента утверждения.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Организация и проведение лабораторных исследований
на иерсиниозы на территориальном, региональном и
федеральном уровнях

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУ) определяют организацию и порядок проведения исследований на иерсиниозы в лабораториях территориального, регионального и федерального уровней.

1.2. МУ предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы медицинскими и другими организациями, независимо от организационно-правовой формы и формы собственности.

2. Нормативные и методические документы

В настоящих методических указаниях использованы ссылки и положения следующих нормативных и методических документов:

2.1. Федеральный закон от 03.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

2.2. Постановление Правительства Российской Федерации от 16.04.2012 № 317 «О лицензировании деятельности в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных (за исключением случая, если указанная деятельность осуществляется в медицинских целях) и генно-инженерно-модифицированных организмов III - IV степени потенциальной опасности, осуществляемой в замкнутых системах».

2.3. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 24.02.2009 № 11 «О представлении внеочередных донесений о чрезвычайных ситуациях в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера».

2.4. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 7.07.2009 № 415н «Об утверждении квалификационных требований к специалистам с высшим и послевузовским медицинским и фармацевтическим образованием в сфере здравоохранения».

2.5. Приказ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 17.03.2008 № 88 «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней».

2.6. СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами».

2.7. СП 1.3.1318-03 «Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I - IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами».

2.8. СП 1.3.2322-08 «Санитарно-эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

2.9. СП 1.3.2518-09 «Санитарно-эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Дополнения и изменения № 1 к СП 1.3.2322-08».

2.10. МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности».

2.11. МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред».

2.12. МУ 3.1.2438-09 «Эпидемиологический надзор и профилактика псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза».

2.13. МУК 4.2.2746-10 «Порядок применения молекулярно-генетических методов при обследовании очагов острых инфекций с групповой заболеваемостью».

2.14. СП 3.1.7.2615-10 «Профилактика иерсиниозов».

3. Перечень сокращений

БХ - бульон Хоттингера

ЗФР - забуференный физиологический раствор

ИФА - иммуноферментный анализ

ЛПО - лечебно-профилактические организации

МО - медицинские организации

ОРА - ориентировочная реакция агглютинации

ПУС - полиуглеводная среда

ПК - пептонно-калиевая среда

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - реакция агглютинации

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

СанПиН - санитарные правила и нормы

СБТС - среда с бромтимоловым синим

СП - санитарно-эпидемиологические правила

УСС - универсальный скошенный столбик

4. Общие положения

Yersinia pseudotuberculosis (возбудитель псевдотуберкулеза) и Yersinia enterocolitica (возбудитель кишечного иерсиниоза) - энтеропатогенные иерсинии, относимые к возбудителям зооантропонозных инфекций. Заражение Y. pseudotuberculosis происходит через инфицированные продукты питания (преимущественно овощи), Y. enterocolitica - чаще при употреблении в пищу молочных и мясных продуктов.

Иерсиниозы широко распространены в мире. В ряде стран Европы кишечный иерсиниоз занимает третье место по заболеваемости среди кишечных инфекций, после кампилобактериоза и сальмонеллеза. Заболеваемость псевдотуберкулезом в Российской Федерации регистрируется практически повсеместно, преимущественно в виде вспышек, кишечным иерсиниозом - в виде спорадических случаев.

Характеристика иерсиний

Род Yersinia включает группу грамотрицательных, не образующих спор, палочковидных (кокки или овоиды) факультативно-анаэробных микроорганизмов, относящихся к семейству Enterobacteriaceae. Среди 17 видов, входящих в род Yersinia, три отнесены к патогенным для человека и животных - возбудитель чумы Y. pestis, возбудитель псевдотуберкулеза Y. pseudotuberculosis и 11 представителей вида Y. enterocolitica патогенных биотипов 1В и 2-5.

Y. enterocolitica биотипа 1А относят к непатогенным, однако они могут быть возбудителями оппортунистических инфекций. Также непатогенными являются 13 видов иерсинии: Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii, Y. rohdei, Y. ruckeri, Y. aleksiciae, Y. similis, Y. massiliensis, Y. nurmii, Y. pekkanenii, Y. entomophaga.

Основные биохимические свойства Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica и некоторых других представителей Enterobacteriaceae, которые используются в практической работе при первичном изучении выделенных культур, представлены в табл. 1 и 2.

По О-антигену известен 21 серотип Y. pseudotuberculosis. Среди Y. enterocolitica различают 6 биотипов и 30 серотипов, из них 9 наиболее часто ассоциируются с заболеваниями человека: 0:3; 0:4; 0:5,27; 0:9; 0:8; 0:13; 0:18; 0:20; 0:21 (табл. 3).

Антигенное родство (по О-антигену) Y. pseudotuberculosis и большинства серотипов Y. enterocolitica выражено слабо. Значительное сходство по антигенной структуре выявлено у Y. pseudotuberculosis серотипа 0:1 и Y. enterocolitica «американских» серотипов 0:8; 0:18 и 0:21.

Таблица 1

Основные дифференциальные признаки Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica и других представителей семейства Enterobacteriaceae

Таблица 2

Основные биохимические свойства бактерий рода Yersinia (26 ± 2) °С

Таблица 3

Био- и серотипы Y. enterocolitica и их связь с патогенностью

Температурный фактор является одним из важнейших определяющих изменчивость микробов и устойчивость их во внешней среде. Оптимальная температура для жизнедеятельности иерсиний - 28 - 30 °С, однако они могут, хотя и гораздо медленнее, размножаться при температуре 4 - 1 °С.

Достаточно долго иерсинии выживают на различных продуктах питания и даже могут на них размножаться (например, на овощах, особенно приготовленных в виде салатов). В молоке сохраняются до 18 суток, в сливочном масле - до 145 суток, на хлебе, кондитерских изделиях - от 16 до 24 суток. Иерсинии чувствительны к высокой температуре: при 100 °С погибают в течение нескольких секунд, однако при температуре 50 - 60 °С способны выживать до 20 - 30 мин, переносят большие (до 10 %) концентрации раствора натрия хлорида, особенно при низких температурах. На микробы губительно действует прямая солнечная радиация, чувствительны иерсинии и к высыханию. Во влажной среде и невысокой температуре (14 - 18 °С) выживают длительно. Кислотность среды (при уровнях рН 3,6 - 4,0) также губительна для иерсиний. В дезинфицирующих растворах в стандартных разведениях микробы Yersinia погибают в течение 5 - 10 мин. Раствор перманганата калия в концентрации 0,5 - 0,3 % вызывает гибель бактерий через 3 мин.

Патогенные Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica обладают широким набором факторов патогенности, детерминируемых хромосомными и плазмидными генами.

Способность Y. pseudotuberculosis к адгезии и инвазии в клетки эпителия кишечника зависит от экспрессии хромосомного inv-гена, кодирующего синтез белка наружной мембраны инвазина с молекулярной массой 108 кДа. Диссеминация микроба в организме хозяина связана с функционированием группы хромосомных генов, ответственных за ассимиляцию ионов железа («остров высокой патогенности», HPI). Штаммы Y. pseudotuberculosis, содержащие HPI, редко выделяются в России (3,9 %), в основном они циркулируют в Европе, Австралии, Северной Америке.

Важным фактором патогенности Y. pseudotuberculosis является синтез суперантигена (YPM), ответственного за поликлональную активацию Т-лимфоцитов и гиперпродукцию провоспалительных цитокинов. Клинически это выражается развитием синдрома токсического шока. У 98 % штаммов этого вида, выделенных от больных в России, Японии, Корее, обнаруживается суперантиген, вызывающий системное поражение органов и тканей.

Патогенные Y. enterocolitica также имеют факторы патогенности, обеспечивающие им адгезивные и инвазивные свойства (ген ail).

Гены НРI не выявляются у непатогенных Y. enterocolitica биотипа 1А и у низкопатогенных штаммов биотипов 2-5, но они определяются у всех высокопатогенных штаммов биотипа 1B. Энтеротоксигенность Y. enterocolitica биотипов 1В и 2-5 связана с экспрессией хромосомного гена ystA. У непатогенных представителей биотипа 1А обнаружен ген ystB.

Плазмидой вирулентности иерсиний pYV 42 - 48 MDa обладают все штаммы Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica 1В, 2-5 биотипов. Основная функция плазмиды pYV - нейтрализация факторов иммунитета макроорганизма.

Плазмида с молекулярной массой 82 MDa (pVM) обнаружена только у Y. pseudotuberculosis 1 серотипа. Штаммы, имеющие плазмиду pVM, вызывают более тяжелое течение псевдотуберкулеза.

5. Порядок организации и проведения лабораторных исследований на иерсиниозы для лабораторий территориального уровня

5.1. Рекомендованный порядок организации и проведения лабораторных исследований на иерсиниозы в материале от людей в лабораториях лечебно-профилактических организаций

5.1.1. Требования к лабораториям, осуществляющим исследования на иерсиниозы

Наличие разрешительных и регламентирующих работу документов

Лаборатории, которые осуществляют исследования на иерсиниозы, должны иметь разрешительные документы на этот вид деятельности согласно действующему законодательству.

Проведение исследований на всех этапах: взятие проб, их хранение, доставка в лабораторию, регистрация, порядок исследования, выдача результатов должны соответствовать требованиям действующих нормативных и методических документов.

Обеззараживание отходов должно осуществляться в соответствии с действующими нормативными и методическими документами по обращению с медицинскими отходами.

Требования к специалистам и вспомогательному персоналу, участвующим в выполнении исследований на иерсиниозы

Исследования на иерсиниозы могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским образованием, имеющие допуск к работе с ПБА III - IV групп патогенности на основании приказа руководителя учреждения, окончившие курсы по специальности «Бактериология», знающие правила работы с ПБА III - IV группы патогенности. Специалисты должны проходить профессиональную переподготовку не реже одного раза в пять лет. Лица, имеющие высшее (среднее) медицинское образование должны иметь сертификат специалиста («Бактериология»/«Лабораторное дело»).

Инженерно-технический персонал, дезинфекторы и санитарки проходят специальную подготовку по месту работы в соответствии с должностными обязанностями.

Необходимый уровень подготовки специалистов лабораторий представлен в прилож. 1.

Требования к знаниям и умениям специалистов лабораторий приведены в прилож. 2.

Требования к обеспечению безопасности работы персонала

Каждая бактериологическая лаборатория должна иметь пакет нормативно-методической документации и инструкций, определяющих режим безопасной работы сотрудников с учетом характера работ, особенностей технологии, свойств микроорганизмов. Результаты проверок знаний правил техники безопасности персонала при проведении работ фиксируются в специальном журнале.

Все сотрудники должны выполнять требования по обеспечению безопасности работы с материалом, подозрительным или зараженным возбудителями инфекционных болезней III - IV групп патогенности (опасности) в соответствии с действующими нормативными документами.

Порядок организации внутреннего и внешнего контроля качества лабораторных исследований

Контроль качества исследований на иерсиниозы в лабораториях включает:

·     контроль качества питательных сред, диагностических препаратов и тест-систем, дезинфицирующих средств и химических реактивов;

·     своевременную поверку средств измерений, аттестацию испытательного оборудования;

·     контроль качества стерилизации лабораторной посуды;

·     контроль работы паровых и суховоздушных стерилизаторов;

·     контроль температурного режима работы холодильников и термостатов;

·     контроль работы бактерицидных ламп;

·     проверку состояния воздуха производственных помещений и боксов, температурного режима, влажности;

·     проверку санитарного состояния помещений, включая условия уборки, дезинфекции, контроля смывов с поверхностей и оборудования.

Результаты контроля фиксируют в специальных журналах, формулярах или других учётных документах.

Внешний контроль качества лабораторных исследований включает:

·     участие в межлабораторных сличительных испытаниях (МСИ);

·     участие в Федеральной системе внешней оценки качества (ФСВОК);

·     приобретение шифрованных образцов для идентификации иерсиний.

Правила ведения документации

Ведение лабораторной документации, включая состояние регистрационных и рабочих журналов, осуществляют ежедневно в соответствии с требованиями действующих нормативных и методических документов.

Требования к материальным ресурсам, необходимым для выполнения исследований на иерсиниозы

Для проведения исследований на иерсиниозы в лабораториях должны быть в наличии:

·     питательные среды, зарегистрированные в установленном порядке (прилож. 3 к МУ);

·     диагностические препараты, тест-системы, зарегистрированные в установленном порядке (прилож. 4 к МУ);

·     химические реактивы (прилож. 5 к МУ);

·     приборы и оборудование (прилож. 6 к МУ);

5.1.2. Номенклатура и объем исследований

В лабораториях МО проводят:

·     диагностические исследования материала от госпитализированных в стационар и амбулаторных больных с целью дифференциальной диагностики и установления этиологии заболевания при спорадической и вспышечной заболеваемости;

·     исследования патолого-анатомического материала.

В лабораториях МО проводят исследования материала в следующем объеме:

1) посев на среды накопления, «холодовое обогащение» с периодическими высевами на дифференциально-диагностические среды, отсев характерных по морфологическим свойствам колоний иерсиний на ПУС;

2) идентификация и дифференциация выделенных культур до вида по морфологическим, биохимическим и антигенным свойствам, в том числе с использованием полу- или автоматизированных систем идентификации («Vitek-2», «Mini API», «Микроб-2», «Микроб-Автомат» и др.) при наличии оборудования и тест-систем;

3) выявление антител в парных сыворотках (РА, РНГА, ИФА);

4) экспрессные методы исследования (ПЦР) - при наличии оборудования.

5.1.3. Порядок лабораторных исследований на иерсиниозы

5.1.3.1. Правила отбора и транспортирования проб клинического материала

При проведении бактериологического анализа на иерсиниозы исследуется клинический материал: испражнения, моча, кровь, мазки из зева, операционный или секционный материал: аппендицикулярные отростки, мезентериальные лимфоузлы и патологически измененные органы и ткани, сгустки крови, желчь, содержимое кишечника.

Материал от больного (подозрительного на заболевание) отбирает медицинский персонал МО немедленно при выявлении больного (подозрительного на заболевание) до начала лечения антибиотиками.

При совместном использовании бактериологического и ПЦР методов отбор материала осуществляется в одноразовую посуду.

Правша отбора материала от больных (подозрительных на заболевание):

·     испражнения^* берут на протяжении всего периода заболевания в количестве 0,5 - 1,0 г стерильной ложечкой из судна и помещают в стерильный широкогорлый флакон с 5,0 - 10,0 мл среды накопления;

______________

^* Высеваемость иерсиний наиболее высока в первые 3 - 5 дней болезни и до назначения антибиотиков, результаты бактериологического исследовании улучшаются, если взятие материала производится 3-кратно в течение первой недели болезни (госпитализации).

·     мочу исследуют в первые 7 дней болезни, берут 20 - 30 мл средней порции утренней мочи в стерильную посуду. Осадок после центрифугирования помещают в 5,0 мл среды накопления;

·     смыв из зева берут в первые 3 дня болезни натощак с задней стенки глотки и корня языка тампоном, смоченном в физиологическом растворе и помещают в 5,0 мл среды накопления;

·     кровь исследуют в течение болезни на высоте лихорадки, весь лихорадочный период и в период рецидива болезни. Кровь забирают натощак в количестве 5 - 10 мл из локтевой вены с соблюдением правил асептики, выдерживают при комнатной температуре в наклонном положении (под углом 30 - 45°) до образования сгустка (30 - 40 мин), после чего сгусток отделяют от стенки, сыворотку переносят в пробирку для серологических реакций, а сгусток помещают в 5,0 мл среды накопления.

Правила отбора операционного или секционного материала:

·     Аппендикулярный отросток. Стерильно ножницами измельчают 1,0 - 2,0 г пробы и помещают в 5,0 - 10,0 мл среды накопления.

·     Мезентериальные лимфоузлы, другие органы и ткани. Стерильно ножницами измельчают 1,0 - 2,0 г пробы и помещают в 5,0 - 10,0 мл среды накопления.

·     Желчь. В 5,0 мл среды накопления помещают 0,5 - 1,0 мл.

·     Содержимое кишечника. В 5,0 мл среды накопления помещают 0,5 - 1,0 мл.

·     Сгусток крови. Стерильно измельчают 0,5 - 1,0 мл пробы и помещают в 5,0 мл среды накопления.

Пробы этикетируют, обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором, упаковывают в полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией, заполняют бланк направления и помещают в контейнер для транспортирования биологического материала на исследование.

Транспортирование материала в лабораторию осуществляется при температуре (4 - 12) °С в течение двух часов после взятия.

I этап исследования
(пробоподготовка и посев нативного материала)

Проводят «холодовое обогащение» исследуемого материала: внесенный в среду ПК, в ЗФР или 1 %-ю пептонную воду (среды накопления) материал помещают в холодильник (6 ± 2) °С и выдерживают в нем до первого положительного высева на 2 - 3, 5 - 7 или 10 - 15 сутки.

Постановка ускоренных методов исследования нативного материала: ПЦР или ИФА для выявления антигенов иерсиний псевдотуберкулеза 1 серотипа^*. При получении положительного результата выдают предварительный положительный ответ.

______________

^* Производственный выпуск «Тест-системы иммуноферментной для выявления антигенов иерсиний псевдотуберкулеза 1 серотипа» будет осуществляться в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера с 2012 г.

II этап исследования
(на 2 - 3 сутки от начала исследования)

Проводят высев со сред накопления (2 - 3 сутки «холодового обогащения») на плотные дифференциально-диагностические среды (СБТС, Эндо) или другие коммерческие дифференциальные среды для диагностики иерсиниозов, разрешенные к применению на территории Российской Федерации (среда Мак-Конки и др.) - петлей из верхней трети слоя среды (но не с поверхности!), не взбалтывая пробирки (!).

Для инактивации посторонней микрофлоры перед каждым высевом на плотную питательную среду проводят щелочную обработку материала 0,72 %-м раствором гидроксида калия в 0,5 %-м растворе хлорида натрия (30 - 60 с) или 5 %-м раствором тринатрий фосфата. Посевы инкубируют при (26 ± 2) °С 48 ч (на среде СБТС) или (на среде Эндо) 24 ч (не более 30 ч!).

Ускоренные методы исследования материала из сред накопления (2 - 3-й сутки «холодового обогащения»): ПЦР или ИФА для выявления антигенов иерсиний псевдотуберкулеза 1 серотипа. При получении положительного результата выдают подтверждение предварительного положительного ответа и продолжают бактериологическое исследование пробы до выделения культуры. При отрицательных результатах ПЦР на этапах I - II дальнейшее бактериологическое исследование пробы прекращают.

III этап исследования
(4 - 5-е сутки от начала исследования)

Просмотр посевов на дифференциально-диагностических средах, засеянных на этапе II исследования, и учет морфологии колоний.

Проводят отбор характерных для Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica колоний на дифференциальную среду с мочевиной (среду Олькеницкого, УСС или среды Ресселя I и II)^* и той же колонии - на скошенные столбики (или сектора) МПА (АХ) для накопления бактериальной массы. Посевы инкубируют на средах Олькеницкого, УСС, Ресселя I при (37 ± 1) °С, на МПА (АХ), среде Ресселя II - при (26 ± 2) °С. При наличии сложности отбора колонии на две среды возможен первичный отбор колоний на среды с мочевиной с последующим пересевом уреазоположительных культур на МПА (АХ), среду Рессель II.

______________

^* Прописи сред и способ приготовления представлены в прилож. 8.

IV этап исследования
(5 - 6-е сутки от начала исследования)

Проводят идентификацию и дифференциацию уреазоположительных культур из пробирки (или чашки) с МПА, засеянных на этапе II исследования (2 - 3 сутки «холодового обогащения»):

·     микроскопия мазка, окрашенного по Граму;

·     тест на цитохромоксидазу;

·     ферментативная активность на средах Гисса^** (26 ± 2) °С: маннитол, сахароза, рамноза, раффиноза, сорбитол, мелибиоза, салицин, ксилоза;

______________

^** При использовании сред Ресселя I и II проводят постановку следующих биохимических тестов - сахароза, рамноза, раффиноза, салицин, ксилоза, сорбит, индол.

·     реакция Фогеса-Проскауэра (среда Кларка) при (20 ± 2) °С и (37 ± 1) °С;

·     декарбоксилирование орнитина (среда Биргера-Крушинской) при (37 ± 1) °С;

·     утилизация цитрата (среда Симмонса) при (37 ± 1) °С;

·     дезаминирование фенилаланина (агар с фенилаланином) при (37 ± 1) °С;

·     образование индола (0,3 % полужидкий агар) при (20 ± 2) °С и (37 ± 1) °С;

·     проба с псевдотуберкулезным фагом (агар Хоттингера, МПА) при (26 ± 2) °С;

·     постановка ОРА на стекле с псевдотуберкулезной и иерсиниозной сыворотками - культуры с МПА (АХ), среды Ресселя II;

·     идентификация возбудителя с использованием полу- или автоматизированных систем идентификации («Vitek-2», «Mini API», «Микроб-2», «Микроб-Автомат» или аналоги) - при наличии оборудования и тест-систем.

V этап исследования
(5 - 7-е сутки от начала исследования)

Проводят высев со сред накопления (5 - 7-е сутки «холодового обогащения») на плотные дифференциально-диагностические среды после предварительной щелочной обработки.

Проводят учет результатов биохимической идентификации и дифференциации Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, проведенных на IV этапе исследования (2 - 3-й сутки «холодового обогащения»), определяют биотип Y. enterocolitica.

Проводят реакцию агглютинации на стекле с сывороткой к вирулентным иерсиниям.

Выдача окончательного положительного ответа.

VI этап исследования
(7 - 8-е сутки от начала исследования)

Просмотр посевов на дифференциально-диагностических средах, засеянных на V этапе исследования (5 - 7-е сутки «холодового обогащения»).

Проводят отбор характерных для Y. pseudotuberculosis и Y. Enterocolitica колоний на дифференциальную среду с мочевиной (среду Олькеницкого, УСС или среды Ресселя I и II) и МПА (АХ).

VII этап исследования
(8 - 10-е сутки от начала исследования)

Проводят идентификацию и дифференциацию уреазоположительных культур, засеянных на VI этапе исследования (5 - 7-е сутки «холодового обогащения») по тестам, предусмотренным на IV этапе исследования.

VIII этап исследования
(9 - 11-е сутки от начала исследования)

Проводят учет результатов биохимической идентификации и дифференциации Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, проведенных на VII этапе исследования (5 - 7-е сутки «холодового обогащения»), определяют биотип Y. enterocolitica.

Проводят реакцию агглютинации на стекле с сывороткой к вирулентным иерсиниям.

Выдача окончательного положительного ответа.

IX этап исследования
(10-е сутки от начала исследования)

Проводят высев со сред накопления на дифференциально-диагностические среды после предварительной щелочной обработки (10-е сутки «холодового обогащения»).

X этап исследования
(12-е сутки от начала исследования)

Просмотр посевов на дифференциально-диагностических средах, засеянных на IX-м этапе исследования (10-е сутки «холодового обогащения»), отбор характерных для Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica колоний на дифференциальную среду с мочевиной (среду Олькеницкого, УСС или среды Ресселя I и II) и агар МПА (АХ).

XI этап исследования
(13-е сутки от начала исследования)

Проводят идентификацию и дифференциацию уреазоположительного изолята, засеянного на Х-м этапе исследования (10-е сутки «холодового обогащения»), по набору биохимических тестов, предусмотренных на IV-м этапе исследования.

XII этап исследования
(14-е сутки от начала исследования)

Проводят учет результатов биохимической идентификации и дифференциации Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, проведенных на XI-м этапе исследования (10-е сутки «холодового обогащения»);

Выдача окончательного положительного ответа.

Передача выделенной культуры для дальнейшей идентификации в специализированную лабораторию возможна на любом этапе исследования.

5.1.3.2. Полимеразная цепная реакция

Для выявления ДНК иерсиний используют наборы для ПЦР, зарегистрированные в установленном порядке. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению. Материал для исследования отбирается в одноразовую пробирку (или контейнер) в соответствии с п. 5.1.3.1 в среду накопления ЗФР (рН 7,2 - 7,4).

Наиболее информативным для ПЦР являются испражнения и кровь в период лихорадки. Материал забирается немедленно при выявлении больного и до назначения антибиотиков (!).

Исследование проб проводят в первые сутки их получения и на 2 - 3 сутки после «холодового обогащения» в ЗФР. Непосредственно перед исследованием проводят пробоподготовку материала, используя набор для выделения ДНК.

При использовании этих методов при пробоподготовке получают препарат суммарной ДНК всех содержащихся в пробе микроорганизмов, что может вызвать ингибирование ПЦР и снижение ее чувствительности. Разработан способ подготовки проб, основанный на использовании щелочной обработки материала, при котором большая часть индигенной микрофлоры погибает и удаляется как супернатант при центрифугировании, а относительно устойчивые к щелочи иерсинии выживают (патент от 27.07.2000 № 2153671):

1. Исследуемый материал (нативный) центрифугируют при 500 - 1000 об./мин 1,5 - 2,0 мин для осаждения грубых частиц или отстаивают 2 - 3 ч при комнатной температуре.

2. Переносят 0,2 - 0,5 мл верхней фазы (в том числе, после «холодового обогащения» в течение 2 - 3 суток) в лунки полистиролового планшета для серологических реакций и смешивают с 0,72 % КОН в таком же объеме.

3. После 30 - 60 с экспозиции проводят посев материала на дифференциально-диагностические среды и сразу же в лунки планшета добавляют 0,2 - 0,5 мл БХ для прекращения действия щелочи как селективного агента.

4. Материал из лунки переносят в пробирку типа «Эппендорф» и центрифугируют на микроцентрифуге при 10000 - 12000 об./мин 3 - 5 мин.

5. Надосадочную жидкость удаляют, осадок дважды промывают дистиллированной водой путем центрифугирования.

6. К осадку добавляют 20 мкл деионизованной воды, прогревают 10 мин при 100 °С, центрифугируют при 12000 об./мин 2 мин. Для ПЦР используют 1 - 3 мкл надосадочной жидкости.

5.1.3.3. Иммунологические методы выявления специфических антигенов

Для выявления антигенов иерсинии используют тест-систему иммуноферментную для выявления антигенов иерсинии псевдотуберкулеза I серотипа.

Материал для исследования, сроки и правила его взятия аналогичны п. 5.1.3.1.

Исследование проб проводят в первые сутки их получения и затем на 3 - 5-е сутки после «холодового обогащения» в среде ПК. Непосредственно перед исследованием материал инактивируют 30 мин при (56 ± 1) °С, центрифугируют при 3000 об./мин и берут для исследования надосадочную жидкость. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению.

5.1.3.4. Серологическое исследование на иерсиниозы

Для исследования требуется две пробы крови, взятые в разные периоды заболевания (парные сыворотки!): 1-я неделя начала заболевания и конец 2-й, начало 3-й недели болезни.

Серологическая диагностика основывается на появлении или нарастании титра антител в течение болезни. Достоверным считается 2 - 4-кратное и выше нарастание титра антител при исследовании парных сывороток.

Реакция агглютинации (РА). Для постановки РА используют стандартные иерсиниозные антигены распространенных серотипов, представляющие собой 10 млрд. взвесь иерсиний эталонных штаммов в S-форме, убитых формалином и суспендированных в 0,9 %-м растворе хлорида натрия. Перед постановкой микробную взвесь разводят в 10 раз до рабочей концентрации 1 млрд./мл. Реакцию ставят методом равных объемов (0,5 мл сыворотки + 0,5 мл взвеси). Диагностический титр - 1:160.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Для постановки РНГА используют коммерческие эритроцитарные диагностикумы к Y. pseudotuberculosis I серотипа и Y. enterocolitica серотипов 0:3 и 0:9, представляющие собой полисахаридные антигены иерсиний, фиксированные на поверхности формалинизированных бараньих эритроцитов. Методика постановки и учета РНГА приведена в инструкции по применению. При постановке РНГА с псевдотуберкулезным диагностикумом диагностический титр равен 1:100, кишечноиерсиниозными - 1:200.

Для повышения диагностической эффективности РНГА и исключения ложноположительных результатов рекомендуется соблюдать следующие правила при постановке:

1. Непосредственно перед постановкой РНГА чистые полистироловые пластины ополаскивают дистиллированной водой, а затем высушивают.

2. Накануне постановки РНГА эритроцитарный диагностикум разводят 10 мл ЗФР (рН 7,2) и помещают в холодильник на ночь (для регидратации эритроцитов). Диагностикум, используемый сразу после разведения, часто дает нечеткий результат.

3. Исследуемые сыворотки крови, разведенные ЗФР в соотношении 1:25, необходимо прогреть при 56 °С в течение 30 мин для устранения неспецифических гемагглютининов, которые могут содержаться в сыворотках крови людей.

4. Поскольку некоторые сыворотки крови человека содержат антитела к эритроцитам барана (последние используются для конструирования коммерческого диагностикума), рекомендуется предварительно перед использованием провести адсорбцию каждой сыворотки 50 %-й взвесью бараньих эритроцитов (0,1 мл на 1 мл сыворотки) в течение ночи при температуре холодильника.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Для постановки ИФА используют тест-системы «Иерсиниоз-ИФА-IgA», «Иерсиниоз-ИФА-IgM», «Иерсиниоз-ИФА-IgG», предназначенные для выявления антител классов А, М и G к возбудителям кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению.

5.1.4. Регистрация и оформление результатов исследования

Данные о проведении исследований (испытаний) регистрируются в учётной документации, включающей:

·     направления на проведение исследований;

·     журналы регистрации образцов, поступивших на исследование;

·     журналы регистрации результатов исследований.

Результаты каждого исследования (испытания) оформляются по унифицированным формам.

5.2. Порядок организации и проведения лабораторных исследований на иерсиниозы в ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации

5.2.1. Требования к лабораториям филиалов (отделений) ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации, осуществляющим исследования на иерсиниозы

Согласно п. 5.1.1.

5.2.2. Номенклатура и объем исследований

Микробиологические лаборатории филиалов (отделений) ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации при проведении эпидемиологического надзора в соответствии с требованиями СП 3.1.2615-10 «Профилактика иерсиниозов» осуществляют в плановом порядке:

· исследование проб с эпидемически значимых объектов («объекты риска»): смывы с оборудования, инвентаря, овощей, пищевых продуктов в овощехранилищах, мясо- и молокоперерабатывающих предприятиях, объектах торговли продуктами растительного происхождения, пищеблоках объектов общественного питания, общеобразовательных учреждениях, детских и медицинских организациях;

· исследования продуктов животноводства, птицеводства, плодоовощной продукции в разрезе Программы производственного контроля (по согласованию);

· лабораторные исследования материала от больных (подозрительных на заболевание) - осуществляются по согласованию.

По эпидпоказаниям исследованию подлежат:

· материал от людей, находящихся в одинаковых с больными условиях по риску заражения, в эпидемических очагах при проведении эпидемиологического расследования и санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий;

· в эпидемических очагах иерсиниозов или при неблагополучной эпидемиологической ситуации:

° смывы с овощей, фруктов и других продуктов, не подвергающихся термической обработке;

° смывы с поверхности оборудования, инвентаря и тары в овощехранилищах, пищеблоках организованных коллективов, домашних очагах;

° остатки подозреваемых пищевых продуктов (салаты, сок домашнего приготовления, фляжное молоко, творог домашнего приготовления, сырое свиное мясо, субпродукты и т.д.);

° экскременты домашних и сельскохозяйственных животных, смывы с их подстилок;

° помет мелких млекопитающих;

° вода открытых водоемов и из ёмкостей для хранения.

В лабораториях филиалов (отделений) ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации проводят диагностические исследования материала в следующем объеме:

1) посев на среды накопления, «холодовое обогащение» с периодическими высевами на дифференциально-диагностические среды, отсев характерных по морфологическим свойствам колоний иерсиний на ПУС;

2) идентификация и дифференциация выделенных культур до вида возбудителя по морфологическим, биохимическим и серологическим свойствам:

3) выявление антител в парных сыворотках (РНГА, ИФА).

5.2.3. Порядок лабораторных исследований на иерсиниозы в филиалах (отделениях) ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации

5.2.3.1. Правила отбора и транспортирования проб из объектов окружающей среды

Отбор проб и доставку осуществляют специалисты, владеющие методами отбора проб из объектов окружающей среды филиалов (отделений) ФБУЗ «ЦГиЭ».

· Пищевые продукты. В стерильную емкость помещают 25 г каждого продукта.

· Овощи. Одним влажным стерильным тампоном делают смыв не менее чем 10 экз. каждого вида овощей на границе здоровой и загнивающей части, помещают тампон в 5,0 - 10,0 мл среды накопления.

· Смывы с оборудования, инвентаря, тары. Одним влажным тампоном производят смыв с одноименных поверхностей площадью 100 см² каждая, тампон помещают в 5,0 - 10,0 мл среды накопления.

· Вода из емкостей для хранения и открытых водоемов. В стерильные флаконы забирают 1 - 2 л воды.

· Помет. Собирают стерильной палочкой 1 - 2 г и помещают в 5,0 мл среды накопления.

Пробы маркируют, обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором, упаковывают в полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией, заполняют бланк-направление и помещают в контейнер для транспортирования материала для исследования. Транспортирование осуществляют при температуре 4 - 12 °С в течение двух часов после забора.

5.2.3.2. Правила отбора и транспортирования проб от больных (подозрительных на заболевание) и лиц, находящихся с ними в одинаковых условиях по риску заражения.

Материал от больных (подозрительных на заболевание) и лиц, находящихся с ними в одинаковых условиях по риску заражения, забирает медицинский персонал МО немедленно при выявлении больного, до начала лечения антибиотиками.

Пробы маркируют, обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором, упаковывают в полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией и вместе с бланком-направлением транспортируют при 4 - 12 °С в лабораторию МО или филиал (отделение) ФБУЗ «ЦГиЭ» (по договоренности) в течение двух часов после забора.

Взятие материала осуществляют согласно п. 5.1.3.1.

5.2.3.3. Порядок проведения лабораторного исследования на иерсиниозы объектов окружающей среды и материала от людей.

Исследование проб объектов окружающей среды, исследование клинического материала на иерсиниозы, видопринадлежность выделенных культур осуществляют в соответствии с п. 5.1.3.

5.2.4. Регистрация и оформление результатов исследования

Регистрация результатов анализа производится по учетным формам филиалов (отделений) ФБУЗ «ЦГиЭ» согласно п. 5.1.4.

5.2.5. Порядок передачи информации и выделенных культур лабораториями филиалов (отделений) ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании в ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации

Информация о выделенных штаммах Y. pseudotuberculosis и У. enterocolitica в лабораториях филиалов (отделений) ФБУЗ «ЦГиЭ» от людей и объектов окружающей среды передается в ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации.

Культуры Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica направляются в лаборатории ФБУЗ «ЦГиЭ» в субъекте Российской Федерации. Передача и транспортирование осуществляются в соответствии с действующими санитарными правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности. Прилагается паспорт на культуру в одном экземпляре (прилож. 7 к МУ), сопроводительное письмо, акт передачи живых культур.

5.3. Порядок организации и проведения лабораторных исследований на иерсиниозы в лабораториях ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации

5.3.1. Требования к лабораториям ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации

Согласно п. 5.1.1.

5.3.2. Номенклатура и объем исследований

Микробиологические лаборатории ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации проводят в плановом порядке:

·     исследования проб с эпидемиологически значимых объектов «объектов риска» (смывы с оборудования, инвентаря, овощей, пищевых продуктов в овощехранилищах, мясо- и молокоперерабатывающих предприятиях, объектах торговли продуктами растительного происхождения, пищеблоках объектов общественного питания, общеобразовательных учреждениях, детских и медицинских организациях);

·     исследования продуктов животноводства, птицеводства, плодоовощной продукции в разрезе Программы производственного контроля (по согласованию);

·     исследования материала от больных (подозрительных на заболевание) (по согласованию);

·     подтверждение и идентификацию культур иерсиний, выделенных лабораториями МО и филиалами (отделениями) ФБУЗ «ЦГиЭ» по морфологическим, культурально-биохимическим и серологическим свойствам.

По эпидпоказаниям исследованию подлежат:

·     материал от людей, находящихся в одинаковых с больными условиях по риску заражения, в эпидемических очагах при проведении санитарно-противоэпидемических мероприятий;

·     смывы с овощей, фруктов и других продуктов, не подвергающихся термической обработке;

·     смывы с поверхности оборудования, инвентаря и тары в овощехранилищах, пищеблоках организованных коллективов, домашних очагах;

·     остатки подозреваемых пищевых продуктов (салаты, сок домашнего приготовления, фляжное молоко, творог домашнего приготовления, сырое свиное мясо, субпродукты и т.д.);

·     экскременты домашних и сельскохозяйственных животных, смывы с их подстилок;

·     помет мелких млекопитающих;

·     вода открытых водоемов и из ёмкостей для хранения;

·     исследование проб, собранных в ходе эпизоотологического обследования (тонкий кишечник мелких млекопитающих и птиц, брыжейка и мезентеральные лимфоузлы, гнезда грызунов, почва).

В лабораториях ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации проводят исследования материала в следующем объеме:

1) посев на среды накопления, «холодовое обогащение» с периодическими высевами на дифференциально-диагностические среды, отсев характерных для иерсиний колоний на ПУС с одновременным выполнением экспресс-методов диагностики иерсиниозов (ПЦР, Real-time ПЦР);

2) идентификация и дифференциация выделенных культур до вида по морфологическим, биохимическим и антигенным свойствам, в том числе с использованием полу- или автоматизированных систем идентификации («Vitek-2», «Mini API», «Микроб-2», «Микроб-Автомат» или аналоги) при наличии оборудования и тест-систем;

3) индикация и идентификация культур иерсиний с использованием ПЦР, Real-time ПЦР;

4) выявление антител в парных сыворотках (РНГА, ИФА, РА).

5.3.3. Порядок лабораторных исследований на иерсиниозы в ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации

5.3.3.1. Правила отбора и транспортирования проб из объектов окружающей среды.

Отбор и транспортирование материала осуществляют согласно п. 5.2.3.1.

5.3.3.2. Правила отбора и транспортирования клинического материала. Отбор и транспортирование материала осуществляют согласно пп. 5.1.3.1 и 5.2.3.2.

5.3.3.3. Правила отбора проб материала от животных, собранных при обследовании природных или антропоургических очагов иерсиниозов.

Материал, собранный в ходе обследования природных и антропургических очагов, должен быть свежим, поэтому органы животных следует забирать в максимально короткие сроки или соблюдать низкотемпературный режим для транспортировки и хранения полевого материала. Лабораторному исследованию подвергают: тонкий кишечник мелких млекопитающих, птиц, сельскохозяйственных и домашних животных, субстрат гнезд грызунов:

·     Тонкий кишечник. 1,0 - 2,0 г в месте перехода тонкой кишки в толстую с содержимым забирают стерильно и помещают в 5,0 мл среды накопления.

·     Брыжейка, мезентеральные лимфоузлы. 1,0 - 2,0 г стерильно измельчают, 1 мл суспензии помещают в 5,0 мл среды накопления.

·     Гнезда грызунов. Субстраты гнезд (примерно 10 г каждого) растирают в ступке пестиком с фосфатно-буферным раствором, 1,5 мл взвеси вносят в 15,0 мл среды накопления.

5.3.3.4. Порядок проведения лабораторного исследования на иерсиниозы объектов окружающей среды, материала от людей, полевого материала, выделенных культур.

Исследование материала от людей с диагностической целью и по эпидпоказаниям, проб из объектов окружающей среды по эпидпоказаниям проводят в соответствии с п. 5.1.3. При осуществлении планового эпизоотологического мониторинга за природными очагами иерсиниозов высевы со сред накопления рекомендуется проводить до 21 суток.

Идентификация выделенной культуры проводится по следующим тестам:

·     характерная морфология колоний;

·     типичные биохимические свойства;

·     чувствительность к псевдотуберкулезному фагу;

·     серологическое типирование с использованием диагностических сывороток к Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica;

·     биотипирование Y. enterocolitica по набору тестов (ферментация салицина, липазная активность, образование индола, ферментация ксилозы, нитратредуктазная активность, реакция Фогес-Проскауэра);

·     определение вирулентности иерсиний по фенотипическим признакам (тест на аутоагглютинацию, определение кальцийзависимости роста иерсиний);

·     РА на стекле с сывороткой к вирулентным иерсиниям.

5.3.4. Регистрация и оформление результатов исследования

Регистрация результатов анализа производится по учетным формам ФБУЗ «ЦГиЭ» согласно п. 5.1.4.

5.3.5. Порядок передачи информации и выделенных культур лабораториями ФБУЗ «Центр гигиены эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации в Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней II - IV групп патогенности

Информация о выделенных или идентифицированных культурах Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica передается в Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней II - IV групп патогенности.

Культуры иерсиний, выделенных от людей, мелких млекопитающих и объектов окружающей среды, и идентифицированные в лабораториях ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации передаются в установленном порядке в Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней II - IV групп патогенности. Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с СП по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов II - IV групп патогенности. Прилагается паспорт на культуру, сопроводительное письмо и акт передачи патогенных биологических агентов III - IV групп за пределы организации.

6. Порядок организации и проведения исследований на иерсиниозы для лабораторий регионального уровня

6.1. Порядок организации и проведения исследований на иерсиниозы в лабораториях Региональных центров по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II - IV групп патогенности в федеральных округах

6.1.1. Требования к лабораториям Региональных центров по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II - IV групп патогенности

Согласно п. 5.1.1.

6.1.2. Номенклатура и объем исследования

Лаборатории Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней II - IV групп патогенности проводят:

·     верификацию культур иерсиний и их расширенную идентификацию;

·     диагностические исследования материала от больных и объектов окружающей среды - в случае отсутствия диагностических возможностей на местах, трудности дифференциальной диагностики, наличия тяжелых и атипичных форм инфекции и т.д.;

·     исследование проб, собранных в ходе эпизоотологического обследования природных и антропургических очагов иерсиниозов;

·     контроль качества питательных сред.

Лаборатории Региональных центров по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II - IV групп патогенности проводят исследования в следующем объеме:

·     идентификация культур, доставленных (определение биотипа, серотипа возбудителя, определение вирулентности культуры по фенотипическим признакам);

·     индикация и идентификация культур иерсиний при использовании ПЦР, Real-time ПЦР;

·     посев на среды накопления с одновременным выполнением экспресс-методов диагностики (ПЦР, Real-time ПЦР);

·     высев со сред накопления на дифференциально-диагностические среды, отсев подозрительных колоний для последующей родовой и видовой дифференциации;

·     идентификация возбудителя с использованием полу- или автоматизированных систем идентификации («Vitek-2», «Mini API», «Микроб-2», «Микроб-Автомат» или аналоги) при наличии оборудования.

6.1.3. Организация и обеспечение исследований на иерсиниозы в лабораториях Региональных центров по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II - IV групп патогенности

Порядок исследований клинического материала, проб из объектов окружающей среды, грызунов, птиц, материала от сельскохозяйственных и домашних животных проводят в соответствии с п. 5.1.3.

К подтверждающим тестам относительно Y. pseudotuberculosis/Y. enterocolitica относятся:

·     характерная морфология колоний;

·     типичные биохимические свойства;

·     чувствительность к псевдотуберкулезному бактериофагу;

·     серологическое типирование с использованием диагностических сывороток к Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis;

·     биотипирование Y. enterocolitica по набору тестов (ферментация салицина, ксилозы, образование индола, редукция нитратов, реакция Фогес-Проскауэра);

·     тест на аутоагглютинацию, определение кальций зависимости роста иерсиний, определение температурозависимой морфологии колоний; РА на стекле для выявления вирулентных иерсиний с СВИ;

·     определение чувствительности к антибиотикам дискодиффузионным методом;

·     определение видоспецифических ДНК-мишений методом ПЦР.

6.1.4. Регистрация и оформление результатов исследования

Регистрация результатов исследования оформляется согласно п. 5.1.4.

6.1.5. Порядок передачи информации и выделенных культур лабораториями Региональных центров по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II - IV групп патогенности в Референс-центры

Информация о выделенных и идентифицированных культурах Y. pseudotuberculosis и патогенных Y. enterocolitica передается в Референс-центр по мониторингу за возбудителями иерсиниозов (ФБУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора) и Референс-центр по мониторингу за возбудителями природно-очаговых инфекций (ФКУЗ «Иркутский НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора).

При невозможности проведения диагностических исследований для установления причинно-следственной связи при работе в эпидемическом очаге, верификации и расширенной идентификации культур в Региональном центре по мониторингу за возбудителями II - IV групп патогенности лабораторные исследования (пп. 6.1.2 и 6.1.3) проводятся в других Региональных центрах по мониторингу за возбудителями II - IV групп патогенности по согласованию с Референс-центром по иерсиниозам (Региональные опорные базы-консультантов). Лаборатории данных центров должны соответствовать требованиям, изложенным в п. 5.1.1.

Культуры Y. pseudotuberculosis и патогенных Y. enterocolitica от людей, грызунов и объектов окружающей среды, идентифицированные в лабораториях ФБУЗ «ЦГиЭ» в субъекте РФ, Региональных центрах по мониторингу возбудителей II - IV групп патогенности и в Региональных опорных базах - консультантов в федеральных округах передаются в установленном порядке в Референс-центр по иерсиниозам, а для территорий Сибирского и Дальневосточного федеральных округов - в Референс-центр по природно-очаговым инфекционным болезням.

Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с действующими СП по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов II - IV групп патогенности. Прилагается паспорт на культуру (прилож. 7 к МУ), сопроводительное письмо и акт передачи патогенных биологических агентов III - IV групп за пределы организации.

7. Порядок организации и проведения исследований на иерсиниозы в лабораториях федерального уровня (Референс-центр по мониторингу за иерсиниозами, Референс-центр по мониторингу за возбудителями природно-очаговых инфекционных болезней)

7.1. Требования к лабораториям Референс-центра по мониторингу за иерсиниозами и Референс-центра по мониторингу за возбудителями природно-очаговых инфекционных болезней

Согласно п. 5.1.1.

7.2. Номенклатура и объем исследований

Диагностические лаборатории Референс-центров проводят:

· расширенную идентификацию и изучение биологических, биохимических, молекулярно-генетических характеристик иерсиний, в том числе культур с атипичными свойствами;

· проводят генотипирование иерсиний современными методами;

· проводят исследования клинического материала, проб из объектов окружающей среды и проб полевого материала - на договорной основе;

· оказывают консультативно-методическую помощь по проведению лабораторных исследований на иерсиниозы организациям Роспотребнадзора и здравоохранения в субъектах Российской Федерации;

· обеспечивают повышение профессиональной подготовки специалистов лабораторного звена организаций Роспотребнадзора и здравоохранения при наличии соответствующих разрешительных документов;

· направляют в Государственные коллекции штаммы иерсиний в установленном порядке;

· организуют работы по внешнему контролю качества лабораторных исследований и мониторинга за иерсиниями по согласованию с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

7.3. Организация и обеспечение деятельности при мониторинге за иерсиниозами

Материалом для исследования служат культуры иерсиний, в том числе культуры с атипичными свойствами, выделенные в лабораториях территориального (муниципального) и регионального уровней; клинический материал, сыворотка крови больных иерсиниозами и подозрительных на инфекцию лиц, пробы из объектов окружающей среды и полевой материал по эпидпоказаниям и на договорной основе.

При исследовании культур возбудителей иерсиниозов, в том числе культур с атипичными свойствами, используют биологические и современные высокотехнологичные методы бактериологического, иммуносерологического и молекулярно-генетического анализа, а также современные серологические методы исследования сывороток крови больных иерсиниозами и подозрительных на эти инфекции, обследуемых по эпидпоказаниям.

Порядок исследования клинического материала, проб из объектов окружающей среды, мелких млекопитающих на иерсиниозы соответствуют п. 5.1.3.

Идентификация поступивших культур осуществляется по полной схеме:

· характерная морфология колоний;

· изучение биохимических свойств на расширенной биохимической панели, определение биотипа Y. enterocolitica;

· постановка развернутой реакции агглютинации с иерсиниозными агглютинирующими сыворотками (к Y. enterocolitica серотипов 0:3; 0:5,27; 0:8; 0:9 и др.; к Y. pseudotuberculosis серотипов 0:1, 0:3);

· определение детерминант патогенности в ПЦР (гены «острова высокой патогенности» НРI; «острова патогенности» YAPI; гены адгезии - инвазии inv, ail, гены энтеротоксинов ystA, ystB, гены плазмиды вирулентности иерсиний);

· определение чувствительности к антибиотикам (диско-диффузионным методом, методом разведений в агаре и бульоне);

· определение плазмидного спектра выделенных штаммов;

· определение серо- генотипа ПЦР (в случае отсутствия диагностических сывороток);

· электрофорез в пульсирующем поле (PFGE) - определение пульсотипа;

· мультилокусный вариабельный анализ (MLVA);

· определение вирулентности Y. pseudotuberculosis (определение LD₅₀ при пероральном заражении белых мышей с помощью зонда; постановка кератоконъюнктивальной пробы на морских свинках).

При идентификации культур иерсиний с атипичными свойствами используют дополнительные биохимические, серологические, иммунологические и другие методы для подтверждения принадлежности культур к роду Yersinia и известным видам:

· расширенная панель биохимических тестов;

· ПЦР с использованием дополнительных специфических праймеров;

· постановка иммуносерологических реакций с использованием моноклональных антител.

Окончанием идентификации должно быть составление молекулярного профиля возбудителя.

7.4. Порядок взаимодействия лабораторий Референс-центра по мониторингу за иерсиниозами с организациями Роспотребнадзора

Информация об идентифицированных культурах иерсиний направляется в Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней II - IV групп патогенности по согласованию с Референс-центром по иерсиниозам. Оригинальные штаммы иерсиний, идентифицированные в бактериологических лабораториях Референс-центров, передаются в Государственную коллекцию штаммов микроорганизмов Национального центра верификации диагностической деятельности ФКУЗ «РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора.

Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с СП по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности. Прилагается паспорт на культуру в одном экземпляре, сопроводительное письмо, акт передачи патогенных биологических агентов III - IV групп за пределы организации.

Приложение 1

Подготовка кадров по лабораторным исследованиям иерсиниозов

Приложение 2

Требования к профессиональным навыкам специалистов, осуществляющих лабораторные исследования иерсиниозов

1. Требования к знаниям и умениям специалистов МО, выполняющих исследования на иерсиниозы

1.1. Врачи-бактериологи, врачи-лаборанты ПЦР-лаборатории должны знать:

·     основные положения клинико-эпидемиологических проявлений иерсиниозов и характеристику иерсиний, особенности лабораторного обследования больного в соответствии с клиническими формами заболеваний;

·     нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на иерсиниозы;

· требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на зараженность возбудителями III - IV групп патогенности;

· порядок сбора, хранения, обеззараживания, утилизации биологических отходов;

· порядок доставки, приёма, регистрации клинического материала;

· порядок проведения работ, обеспечивающих лабораторное исследование (подготовка диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовка клинического материала);

· этапы лабораторного исследования;

· методы лабораторного исследования;

· морфологические, культуральные, серологические, биохимические, вирулентные, молекулярно-биологические свойства иерсиний;

· порядок работы на лабораторном оборудовании;

· порядок выдачи результатов лабораторного исследования;

· порядок, сроки передачи культур иерсиний в специализированную лабораторию для дальнейшего изучения;

· требования биологической безопасности при передаче ПБА.

1.2. Врачи-бактериологи должны уметь:

· проводить отбор типичных для иерсиний колоний с питательных сред;

· проводить пересев колоний на полиуглеводные среды;

· проводить биотипирование выделенных культур Y. enterocolitica;

· проводить с выделенными культурами Y. enterocolitica РА с сывороткой к вирулентным иерсиниям;

· проводить учёт полученных морфологических, культуральных, серологических, биохимических, вирулентных свойств исследуемого микроорганизма;

· проводить учёт серологического исследования крови;

· выдавать ответ по результатам исследований;

·     готовить культуры, материал для передачи в специализированную лабораторию;

· вести необходимую документацию.

1.3. Врачи-лаборанты ПЦР-лаборатории должны уметь:

· готовить рабочее место для проведения ПЦР-исследования;

· проводить выделение нуклеиновых кислот, амплификацию, учёт результатов;

· проводить обеззараживание рабочего места после окончания работ;

· выдавать ответ по результатам исследований;

· вести необходимую документацию.

1.4. Лаборанты-бактериологи должны знать:

· нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на иерсиниозы;

· требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на заражённость возбудителями III - IV групп патогенности;

· порядок сбора, хранения, обеззараживания, утилизации биологических отходов;

· порядок доставки, приёма, регистрации клинического материала:

· порядок проведения работ, обеспечивающих лабораторное исследование (подготовка диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовка клинического материала);

· этапы лабораторного исследования;

· методы лабораторного исследования;

· порядок работы на лабораторном оборудовании.

1.5. Лаборанты-бактериологи должны уметь:

· принимать, регистрировать клинический материал, оценивать соблюдение требований доставки клинического материала;

· проводить подготовку диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовку клинического материала;

· выполнять первичные посевы клинического материала, пересевы со сред обогащения, проведение биохимических тестов;

· выполнять постановку серологических реакций (РА, ИФА, РНГА);

· готовить дезинфицирующие средства, обеззараживать посевы, биологические отходы;

· готовить культуры, материал для передачи в специализированную лабораторию;

· готовить рабочие места врача и лаборанта, после окончания работ проводить обеззараживание;

· вести необходимую документацию.

1.6. Лаборанты ПЦР-лаборатории должны уметь:

· принимать, регистрировать клинический материал, оценивать соблюдение требований забора, доставки клинического материала;

· готовить рабочее место для проведения ПЦР-исследования;

· проводить пробоподготовку клинического материала;

· проводить выделение нуклеиновых кислот;

· проводить обеззараживание рабочего места после окончания работ;

· готовить дезинфицирующие средства, обеззараживать биологические отходы.

2. Требования к знаниям и умениям специалистов филиалов (отделения^*) ФБУЗ ЦГиЭ, выполняющих исследования на иерсиниозы

2.1. Врачи-бактериологи должны знать:

· основные положения эпидемиологического надзора за иерсиниозами, в том числе контингент обследуемых, клинические формы заболеваний, виды исследуемых проб из объектов окружающей среды;

· нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на иерсиниозы;

· требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на заражённость возбудителями III - IV групп патогенности;

· порядок сбора, хранения, обеззараживания, утилизации биологических отходов;

· порядок доставки, приема, регистрации клинического материала, проб из объектов окружающей среды;

· порядок проведения работ, обеспечивающих лабораторное исследование (подготовка диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовка материала);

· этапы лабораторного исследования;

· методы лабораторного исследования;

· морфологические, культуральные, серологические, биохимические, вирулентные свойства иерсиний;

· порядок работы на лабораторном оборудовании;

· порядок выдачи результатов лабораторного исследования;

· порядок, сроки передачи культур иерсиний в специализированную лабораторию для дальнейшего изучения;

· требования биологической безопасности при передаче ПБА в другую организацию.

2.2. Врачи-бактериологи должны уметь:

· проводить отбор типичных для иерсиний колоний с питательных сред;

· проводить пересев колоний на полиуглеводные среды;

· проводить биотипирование выделенных культур Y. enterocolitica;

· проводить с выделенными культурами Y. enterocolitica PA с сывороткой к вирулентным иерсиниям;

· проводить учёт полученных морфологических, культуральных, серологических, биохимических свойств и маркеров вирулентности исследуемого микроорганизма;

· проводить учёт серологического исследования крови;

· выдавать ответ по результатам исследований;

· готовить культуры, материал для передачи в специализированную лабораторию;

· вести необходимую документацию.

2.3. Лаборанты должны знать:

· нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на иерсиниозы;

· требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на заражённость возбудителями III - IV групп патогенности;

· порядок сбора, хранения, обеззараживания, утилизации биологических отходов;

· порядок доставки, приёма, регистрации клинического материала, проб из внешней среды;

· порядок проведения работ, обеспечивающих лабораторное исследование;

· этапы лабораторного исследования;

· методы лабораторного исследования;

· порядок работы на лабораторном оборудовании.

2.4. Лаборанты должны уметь:

· принимать, регистрировать клинический материал, оценивать соблюдение требований доставки клинического материала;

· проводить подготовку диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовку исследуемого материала;

· выполнять первичные посевы клинического материала, пересевы со сред обогащения, проведение биохимических тестов, тестов на маркеры вирулентности иерсиний - аутоагглютинации, кальцийзависимости;

· выполнять постановку серологических реакций (РА, ИФА, РНГА);

· готовить дезинфицирующие средства, обеззараживать посевы, биологические отходы;

· готовить рабочие места врача и лаборанта, после окончания работ проводить обеззараживание;

· готовить культуры, материал для передачи в специализированную лабораторию;

· вести необходимую документацию.

3. Требования к знаниям и умениям специалистов региональных центров по мониторингу за возбудителями (II - IV групп патогенности), ФБУЗ ЦГиЭ, выполняющих исследования на иерсиниозы

3.1. Врачи-бактериологи должны знать:

· основные положения эпидемиологического надзора за иерсиниозами, в том числе контингенты обследуемых, клинические формы заболеваний, виды исследуемых проб от людей, из объектов окружающей среды;

· порядок организации и обеспечения консультативной и практической помощи лабораториям ЛПУ, филиалов (отделения) ФБУЗ ЦГиЭ, ФБУЗ ЦГиЭ территориального уровня;

· нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на иерсиниозы;

· требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на заражённость возбудителями III - IV групп патогенности;

· порядок сбора, хранения, обеззараживания, утилизации биологических отходов;

· порядок доставки, приёма, регистрации клинического материала, проб из внешней среды;

· порядок проведения работ, обеспечивающих лабораторное исследование (подготовка диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовка материала):

· этапы лабораторного исследования;

· методы лабораторного исследования;

· морфологические, культуральные, серологические, биохимические, вирулентные, молекулярно-биологические свойства иерсиний;

· порядок работы на лабораторном оборудовании;

· порядок выдачи результатов лабораторного исследования;

· порядок, сроки передачи культур иерсиний в Референс-центр по иерсиниозам для дальнейшего изучения;

· требования биологической безопасности при передаче ПБА в другую организацию.

3.2. Врачи-бактериологи должны уметь:

· проводить отбор типичных для иерсиний колоний с питательных сред;

· проводить посев на полиуглеводные среды;

· проводить типирование выделенных культур Y. enterocolitica на наличие маркеров вирулентности:

· проводить с выделенными культурами Y. enterocolitica РА с сывороткой к вирулентным иерсиниям;

· проводить серологическое типирование культур иерсиний;

· проводить учёт полученных морфологических, культуральных, серологических, биохимических свойств и маркеров вирулентности исследуемого микроорганизма;

· проводить учёт серологического исследования крови;

· выдавать ответ по результатам исследований;

· готовить культуры, материал для передачи в лаборатории Регионального центра по мониторингу за возбудителями I - II группы патогенности. Референс-центр по иерсиниозам;

· вести необходимую документацию.

3.3. Врачи ПЦР-лаборатории должны уметь:

· готовить рабочее место для проведения ПЦР-исследования;

· проводить выделение нуклеиновых кислот, амплификацию, учёт результатов;

· проводить обеззараживание рабочего места после окончания работ;

· выдавать ответ по результатам исследований;

· вести необходимую документацию.

3.4. Лаборанты должны знать:

· нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на иерсиниозы;

· требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на заражённость возбудителями III - IV групп патогенности;

· порядок сбора, хранения, обеззараживания, утилизации биологических отходов;

· порядок доставки, приёма, регистрации клинического материала;

· порядок проведения работ, обеспечивающих лабораторное исследование;

· этапы лабораторного исследования;

· методы лабораторного исследования.

3.5. Лаборанты-бактериологи должны уметь:

· принимать, регистрировать клинический материал, оценивать соблюдение требований забора, доставки клинического материала;

· проводить подготовку диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовку клинического материала;

· выполнять первичные посевы клинического материала, пересевы со сред обогащения, проведение биохимических тестов, тестов на маркеры вирулентности иерсиний - аутоагглютинации, кальцийзависимости;

· выполнять постановку серологических реакций (РА, ИФА, РНГА);

· готовить дезинфицирующие средства, обеззараживать посевы, биологические отходы;

· готовить рабочие места врача и лаборанта, после окончания работ проводить обеззараживание;

· вести необходимую документацию.

3.6. Лаборанты ПЦР-лаборатории должны уметь:

· принимать, регистрировать клинический материал, оценивать соблюдение требований забора, доставки клинического материала;

· готовить рабочее место для проведения ПЦР-исследования;

· проводить пробоподготовку клинического материала;

· проводить обеззараживание рабочего места после окончания работ;

· готовить дезинфицирующие средства, обеззараживать биологические отходы.

4. Требования к знаниям и умениям специалистов МО, ФБУЗ ЦГиЭ (филиалов, отделения филиалов), осуществляющих отбор клинического материала, проб объектов окружающей среды для исследования на иерсиниозы

4.1. Специалисты должны знать:

· основные положения эпидемиологического надзора за иерсиниозами, в том числе контингенты обследуемых, клинические формы заболеваний, виды исследуемых проб от людей, из объектов окружающей среды;

· нормативные документы, регламентирующие забор материала, проб для исследований на иерсиниозы;

· требования биологической безопасности при заборе, доставке материала, подозрительного на заражённость возбудителями III - IV групп патогенности;

· порядок доставки клинического материала, проб из внешней среды:

· порядок заполнения сопроводительной документации.

4.2. Специалисты должны уметь:

· проводить отбор проб от людей, из объектов окружающей среды;

· заполнять сопроводительную документацию;

· доставлять клинический материал, пробы из внешней среды в лабораторию в соответствии с требованиями.

Приложение 3

Питательные среды, используемые для проведения лабораторных исследований на иерсиниозы

Приложение 4

Диагностические препараты, тест-системы, используемые для проведения лабораторных исследований на иерсиниозы

Приложение 5

Химические реактивы, используемые для проведения лабораторных исследований на иерсиниозы

Приложение 6

Приборы и оборудование, используемые для проведения лабораторных исследований на иерсиниозы

Приложение 7

ПАСПОРТ
штамма бактерий рода Yersinia (для лабораторий территориального и регионального уровней)

 

12. Тесты патогенности:

13. Другие тесты

 

Приложение 8

Состав и прописи питательных сред для первичного выделения культур

Трехсахарный агар с мочевиной (Рессель I)

Состав:

Приготовление

Твердые ингредиенты помещают в дистиллированную воду в любой последовательности. После того, как растворится агар, смесь нагревают до кипения, добавляют индикаторы - феноловый красный и метиленовый синий. рН 7,0 - 7,2 (в горячем виде среда грязно-зеленого цвета), разливают по пробиркам (5 - 6 мл в каждую) и стерилизуют автоклавированием 15 мин под давлением 0,5 атм.

Свежестерилизованная среда приобретает желтый или желто-оранжевый цвет в результате восстановления (обесцвечивание) метиленового синего при автоклавировании.

Осторожным встряхиванием (!) каждой пробирки в наклонном положении вновь придают еще горячей среде её исходную грязно-серую окраску. Это происходит за счет окисления метиленового синего кислородом воздуха.

Среду скашивают, оставляя столбик высотой 2 см и косую поверхность 4 - 5 см. Застывшая среда должна в течение 2 - 3 дней «дозреть», т.е. приобрести однотонную сиреневато-светло-коричневую окраску, что свидетельствует об окислении, т.е. о восстановлении цветности метиленового синего по всей глубине среды. Посев культуры осуществляют штрихами по скошенной поверхности и уколом в столбик среды.

Трехсахарный агар с сахарозой и маннитом (Рессель II)

Состав:

Приготовление

Ингредиенты вводят в следующем порядке: в холодной воде растворить квасцы, затем добавить крахмал и сухой питательный агар, дать им хорошо раствориться, после чего внести остальные компоненты.

Среду доводят до кипения, устанавливают рН 7,2 - 7,4, разливают в пробирки по 7 - 8 мл, автоклавируют при 0,5 - 0,7 атм. 15 - 20 мин, после чего скашивают. Цвет среды розово-красный.

Универсальный скошенный столбик

Состав:

Приготовление

Ингредиенты вносить в любом порядке. Количество питательного агара, вносимого в среду, зависит от его серии. Если на этикетке указано, что на 100 мл воды его надо брать 5 г, то в среду добавляют 3,5 г, если на этикетке имеется рекомендация 3,5 г на 100 мл, то добавляют 2,5 г. Среду кипятить в течение 10 - 15 мин, разливать в стерильные пробирки по 5 мл, автоклавировать при 0,5 атм. 15 мин, после чего скашивать. Цвет среды абрикосовый.