4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методы микробиологического измерения
концентрации клеток мицелиального
гриба Trichoderma longibrachiatum TW-420
ВКМ F-3880D - продуцента целлюлаз,
b-глюканазы и ксиланазы
в атмосферном воздухе населенных мест
и воздухе рабочей зоны

Сборник методических указаний

по методам контроля

МУК 4.2.3034-12; 4.2.3035-12

Москва 2012

1. Разработаны ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им Н.И. Пирогова» Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).

2. Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 20 июля 2012 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации
клеток мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum
TW-420 BKM F-3880D - продуцента целлюлаз,
b-глюканазы и ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест

Методические указания

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-420 BKM F-3880D - продуцента целлюлаз, b-глюканазы и ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м³ воздуха.

Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля штамма Tr. longibrachiatum TW-420 BKM F-3880D в атмосферном воздухе и оценки соответствия уровня его содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и ГОСТ Р 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в организациях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также в санитарных лабораториях биотехнологических предприятий, микробиологических лабораториях научно-исследовательских институтов, работающих в области гигиены окружающей среды и аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

2. Биологическая характеристика плесневого гриба Tr. longibrachiatum TW-420 BKM F-3880D и его гигиенический норматив

Штамм мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-420 BKM F-3880D является продуцентом комплекса целлюлаз, b-глюканазы и ксиланазы. Получен с помощью методов многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры Tr. longibrachiatum TW-307 BKM F-3865D. Депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН под номером BKM F-3880D.

Растет на агаризованных средах (Мальц-arap, глюкозо-картофельный агар, среда Чапека с дрожжевым автолизатом, сусло-агар) при t 29 - 34 °С в течение 7 суток, рН 3,5 - 5,0.

При росте на Мальц-агаре диаметр колоний достигает 80 - 90 мм на 7-е сутки при росте при t 25 °С. Мицелий развит преимущественно субстратный, воздушный мицелий - скудный, белого цвета. Цвет колонии первоначально белый, затем при формировании спор - зеленый. Обратная сторона колоний имеет светло-зеленовато-желтоватую окраску.

При микроскопировании штамм имеет конидии, которые формируются в многочисленных компактных подушечках диаметром до 2 мм. Конидиеносцы бесцветные, гладкостенные формируются на субстратном мицелии, главные ветви которого длинные и прямые, иногда извитые. Боковые ветви короткие, формируются через неравные интервалы под углом к главным ветвям. Фиалиды одиночные, булавовидные или бутыловидные, размер 5 - 10´2 - 3 мкм. Конидии одноклеточные, зеленоватые, гладкостенные, эллипсоидные размером 4 - 7´2 - 4 мкм собраны в мелкие головки на вершинах фиалид.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность плотной питательной среды и подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

5.2. Реактивы, растворы

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в атмосферном воздухе соблюдают следующие требования.

6.1. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами».

6.2. ГОСТ 12.1.005-88 «Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами».

6.3. ГОСТ 12.1.019-79 «Электробезопасность при работе с электроустановками» и инструкции по эксплуатации прибора.

6.4. Руководство «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980), «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5) °С, атмосферном давлении (760 ± 20) мм рт.ст. и влажности воздуха не более 80 %.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток мицелиального гриба воздух аспирируют при помощи одного из пробоотборников со скоростью 10 - 100 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5 - 20 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента и вида пробоотборника.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методом глюкозо-картофельный агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °С, добавляют глюкозу из расчета 15 - 20 г/л и молочную кислоту из расчета 2,0 мл на 500 мл среды (для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 29 °С. Через 4 - 7 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам и характерной окраске колоний микромицета с обратной стороны чашки.

При выполнении анализа атмосферного воздуха дополнительным методом пробы воздуха отбирают на среду Гетчинсона с добавлением 0,5 %-й карбоксиметилцеллюлозы. Культивируют в термостате при t 28 °С в течение двух суток и проводят окрашивание 0,1 %-м раствором Конго красным. Учет колоний штамма производится по зонам просветления, образующимся в результате ферментации целлюлозы под действием комплекса целлюлаз.

Ростовые свойства всех используемых питательных сред должны быть проверены в соответствии с «Требованиями к ростовым свойствам питательных сред» (Государственная Фармакопея СССР, изд. XI, вып. 2, с. 208), что позволит более полно оценить пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается на 2 - 3 чашки каждой используемой среды.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м³ воздуха производят по формуле:

 где

Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова. рекомендуем применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин. При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента.

Эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см² оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, следовательно за 1 мин - количество бактерий из 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 см². Составляя пропорцию определяем, что за 1 мин на стеклянную чашку Петри оседают клетки из 1,57 л/мин. Количество клеток в 1 м³ воздуха определяем по вышеприведенной формуле, где V - 1,57 л/мин ´ t (время аспирации, мин).

Предлагаемый метод является ориентировочным и может быть использовать как вспомогательный метод.

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Список литературы

1. РД 52.04.186-96 «Руководство по контролю загрязнения атмосферы».

2. ГОСТ Р 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».

3. ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ».