4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Порядок организации и проведения
лабораторной диагностики холеры для
лабораторий территориального,
регионального и федерального уровней

Методические указания
МУК 4.2.2870-11

Москва 2011

1. Разработаны Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (Ю.М. Ломов, Э.А. Москвитина, Н.Р. Телесманич, В.Д. Кругликов, И.Я. Черепахина, В.В. Балахнова, И.В. Архангельская); Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора (В.В. Кутырев, Е.С. Казакова, И.Н. Шарова, Н.А. Осина, С.А. Щербакова, Н.И. Смирнова); Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (С.В. Балахонов, Л.Я. Урбанович, Л.В. Миронова, Е.С. Куликалова, А.С. Кожевникова); Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (В.Н. Савельев); Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Противочумный центр» Роспотребнадзора (В.Е. Безсмертный, С.М. Иванова); Федеральным бюджетным учреждением здравоохранения «(Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (В.Г. Сенникова, М.В. Зароченцев, В.В. Мордвинова); Федеральным государственным учреждением науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора (И.А. Дятлов, С.Ф. Бикетов, Е.И. Баранова, М.В. Храмов, Е.А. Тюрин); Федеральным государственным бюджетным учреждением «ГИСК им. Л.А. Тарасовича» Минздравсоцразвития (И.В. Борисевич, Л.В. Саяпина).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 25 мая 2011 г. и введены в действие с 1 июня 2011 г.

3. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Порядок организации и проведения
лабораторной диагностики холеры для
лабораторий территориального, регионального
и федерального уровней

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания определяют порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней, формы и методы их взаимодействия, номенклатуру и объем исследования, требования к лабораториям, специалистам и персоналу, участвующим в выполнении исследований, материально-техническому обеспечению исследований, биологической безопасности проведения работ.

1.2. Настоящие методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор в Российской Федерации, специалистов противочумных учреждений, органов управления здравоохранением и лечебно-профилактических учреждений.

2. Нормативные ссылки

2.1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

2.2. Постановление Правительства Российской Федерации от 29.10.2007 № 720 «О внесении изменений в п. 5 Положения о лицензировании деятельности, связанной с использованием возбудителей инфекционных заболеваний, утвержденного постановлением Правительства Российской Федерации от 22.01.2007 № 31».

2.3. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 24.02.2009 № 11 «О представлении внеочередных донесений о чрезвычайных ситуациях в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера» (Зарегистрировано в Минюсте РФ 10.04.2009 № 13745).

2.4. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 7.07.2009 № 415н «Об утверждении квалификационных требований к специалистам с высшим и послевузовским медицинским и фармацевтическим образованием в сфере здравоохранения». (Зарегистрирован в Минюсте РФ 9.07.2009 № 14292).

2.5. Приказ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 17.03.2008 № 88 «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней».

2.6. Санитарные правила «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности»: СП 1.2.036-95 (Утв. постановлением Госкомсанэпиднадзора РФ от 28.08.1995 № 14).

2.7. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами». СанПиН 2.1.7.2790-10 (Утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 9.12.2010 № 163. Зарегистрировано в Минюсте РФ 17.02.2011 № 19871).

2.8. Санитарно-эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)». СП 1.3.1285-03 (Утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 15.04.2003 № 42 «О введении в действие санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.1285-03». Зарегистрировано в Минюсте РФ 10.05.2003 № 4545).

2.9. Санитарно-эпидемиологические правила «Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I - IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами». СП 1.3.1318-03 (Утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 30.04.2003 № 85 «О введении в действие санитарно-эпидемиологических правил СП 1.2.1318-03». Зарегистрировано в Минюсте РФ 19.05.2003 № 4558).

2.10. Санитарно-эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». СП 1.3.2322-08 (Утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.O1.2008 № 4 «Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08». Зарегистрировано в Минюсте РФ 21.02.2008 № 11197).

2.11. Санитарно-эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» Дополнения и изменения № 1 к СП 1.3.2322-08»: СП 1.3.2518-09 (Утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 2.06.2009 № 42. Зарегистрировано в Минюсте РФ 8.07.2009 № 14280).

2.12. Санитарно-эпидемиологические правила «Санитарная охрана территории Российской Федерации»: СП 3.4.2318-08 (Утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 22.01.2008 № 3 «Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 3.4.2318-08». Зарегистрировано в Минюсте РФ 3.04.2008 № 11459).

2.13. Санитарно-эпидемиологические правила «Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору за холерой на территории Российской Федерации»: СП 3.1.1.2521-09 (Утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 9.06.2009 № 43 «Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 3.1.1.2521-09». Зарегистрировано в Минюсте РФ 9.07.2009 № 14285).

2.14. Методические указания «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности» МУ 1.3.2569-09.

2.15. Методические указания «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии»: МУ 3.3.2.2124-06.

2.16. Методические указания «Лабораторная диагностика холеры»: МУК 4.2.2218-07.

2.17. Методические указания «Профилактика холеры. Организационные мероприятия. Оценка противоэпидемической готовности медицинских учреждений к проведению мероприятий на случай возникновения очага холеры»: МУ 3.1.1.2232-07.

2.18. Методические указания. «Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чумы, сибирской язвы, холеры, туляремии, бруцеллеза, сапа и мелиоидоза) к антибактериальным препаратам»: МУК 4.2.2495-09.

2.19. Методические указания «Методы контроля бактериологических питательных сред»: МУК 4.2.2316-08.

2.20. Методические указания «Серологические методы в диагностике холеры»: МУК 4.2.2315-08. Дополнения к МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры».

3. Перечень сокращений

АБП - антибактериальные препараты

ИФА - иммуноферментный анализ

ЛПУ - лечебно-профилактическое учреждение

МУ - методические указания

МУК - методические указания по контролю

МФА - метод флуоресцирующих антител

ООИ - особо опасные инфекции

ПБА - патогенный биологический агент

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЧС - противочумная станция

РАО - реакция агломерации объёмная

РА - реакция агглютинации

РИВ - реакция иммобилизации вибрионов

РВА - реакция вибриоцидных антител

СанПиН - санитарные правила и нормативы

СП - санитарные правила

ИХ-тест - иммунохроматографический тест

4. Общие положения

Характеристика болезни и возбудителя холеры

Холера - особо опасная инфекционная болезнь с диарейным синдромом, фекально-оральным механизмом передачи возбудителя инфекции, водным, пищевым и контактным путями распространения.

Возбудитель холеры - холерный вибрион относится к семейству Vibrionaceae, роду Vibrio и виду Vibrio cholerae.

К виду Vibrio cholerae отнесены грамотрицательные, аспорогенные, полиморфные, слегка изогнутые или прямые палочки длиной 1,5 - 3,0 мкм и шириной 0,2 - 0,6 мкм, с одним полярно расположенным жгутиком, который длиннее тела клетки в 2 - 3 раза.

Холерные вибрионы быстро размножаются в 1 %-й пептонной воде, образуя через 6 - 8 ч на поверхности среды нежную пленку. Через 24 ч роста пленка становится грубой, среда слабо мутнеет. На поверхности плотного питательного агара (щелочной агар, рН 8,0) через 18 - 24 ч инкубации рост холерных вибрионов проявляется в формировании крупных (2 - 3 мм), гладких, прозрачных колоний с ровным краем, которые легко эмульгируются в физиологическом растворе. В косо проходящем свете они отсвечивают голубоватым цветом. На элективной среде TCBS на зеленом фоне среды колонии вибрионов круглые, гладкие с ровным краем, плоские, желтого цвета. При более длительной инкубации желтый цвет колоний часто переходит в зеленый.

Холерные вибрионы образуют индофенолоксидазу - тест дифференциации от представителей семейства Enterobacteriaceae, ферментируют глюкозу в аэробных и анаэробных условиях до кислоты без газа - тест дифференциации от представителей родов Pseudomonadaceae, декарбоксилируют лизин и орнитин, но не дигидролизуют аргинин - тесты дифференциации от представителей других семейств (Aeromonas spp., Plesiomonas spp., Enhydrobacter spp., Photobacterium spp.) и отдельных видов рода Vibrio.

Помимо этого, холерные вибрионы расщепляют до кислоты без газа сахарозу, маннозу, крахмал, маннит, не расщепляют арабинозу, салицин, дульцит, инозит. В отдельных случаях ферментацию маннозы холерными вибрионами возможно определить только в анаэробных условиях. Холерные вибрионы восстанавливают нитраты в нитриты, образуют индол, разжижают желатину, продуцируют нейраминидазу, лецитиназу, триглицероллипазу.

V.cholerae по наличию специфического О антигена распределяются на серологические группы. В настоящее время известно 206 серологических О групп холерных вибрионов. Возбудителями холеры являются холерные вибрионы O1 и O139 серологических групп. Холерные вибрионы других не O1/не O139 серологических групп могут вызывать спорадические или групповые случаи диарей, не склонные к эпидемическому распространению.

Холерные вибрионы O1 серогруппы по различиям в полисахаридном компоненте О-антигена делятся на три серовара: Огава, Инаба и Гикошима. Серовар Гикошима не стабилен и реверсирует в один из основных сероваров, преимущественно - Огава. Известен R-антиген холерных вибрионов, описаны штаммы, агглютинирующиеся RO сывороткой и не агглютинирующиеся сыворотками O1, Огава или Инаба.

У холерных вибрионов имеется общий жгутиковый Н-антиген.

Холерные вибрионы в пределах O1 серогруппы делятся на два биовара: классический и эльтор, имеющие существенные фенотипические и генетические отличия. Деление на биовары основывается на чувствительности к холерным диагностическим бактериофагам - классическому и эльтор, чувствительности к 50 ед./мл полимиксина В, агглютинации куриных эритроцитов, образовании ацетилметилкарбинола в реакции Фогес-Проскауэра.

Холерные вибрионы являются носителями умеренных фагов с низкой литической активностью. Известны фаги, активные в отношении холерных вибрионов O1 и не O1, включая O139 серологическую группу, а также с более узким спектром литического действия, в пределах отдельных групп штаммов, например ctx⁺ и ctx^- холерных вибрионов.

Одним из основных факторов вирулентности (и эпидемической значимости) холерных вибрионов, определяющих тяжесть клинической картины при холере, является холерный энтеротоксин или СТ (от англ. - cholera toxin), синтез которого контролируется кластером генов ctxAB.

Описан ряд дополнительных токсинов: Zot и Асе токсины, цитотоксический комплекс RTX, цитотонический фактор Cef, термостабильный токсин ST, NMDCY токсин, шигаподобный токсин Slt, WO7 токсин, cholix toxin. He менее важным фактором вирулентности холерных вибрионов являются токсин-корегулируемые пили адгезии или TCP (от англ. - toxin-coregulated pilus) - ключевой фактор колонизации. За синтез пилей TCP отвечают гены tcpA-F, среди них ген tcpA - за биосинтез основной субъединицы пилей.

Нетоксигенные штаммы холерных вибрионов обладают гемолитической активностью, которая включает активность нескольких компонентов: рициноподобного галактозоспецифичного лектина (hlyA) и комплекса ферментов гидролаз, ведущим из которых является липаза (liрА). Гемолитическая активность является ведущим фактором патогенности у штаммов возбудителей холеры O1 и O139 серогрупп, не имеющих ген холерного токсина. Такие штаммы могут вызывать спорадические случаи диареи различной степени тяжести, но не склонны к широкому распространению. Способность к гемолизу эритроцитов барана в тесте Грейга, коррелирующая с липазной активностью, является визуализированным тестом, свидетельствующим о том, что штамм не может вызывать тяжёлую клиническую картину холеры и не способен к широкому эпидемическому распространению.

Понятие эпидемической значимости базируется на определении комплекса показателей:

·      прямые - выявление гена холерного токсина в ПЦР и определение активности его продукции на кроликах-сосунках;

·      косвенные - отсутствие гемолитической, липазной активности, поздняя ферментация маннита, высокая адгезивная активность in vitro (на модели эритроцитов).

Холерные вибрионы имеют две хромосомы: первую (или большую размером 2960 т.п.н.) и вторую (или малую размером 1070 т.п.н.). На большой хромосоме V.cholerae расположены гены патогенности: ctxAB, кодирующий биосинтез СТ, гены, определяющие продукцию дополнительных холерных токсинов, гены tcpA - F, кодирующие продукцию TCP, а также гены, необходимые для репликации, транскрипции, репарации ДНК, биосинтеза клеточной стенки и О-антигена. Биосинтез O1 антигена определяет кластер генов, обозначенный как wbe. Продукция O139 антигена кодируется кластером генов, также локализованном на большой хромосоме и имеющим обозначение wbf. Выявление с помощью ПЦР генов wbe и wbf, специфичных для холерных вибрионов O1 и O139 серологических групп, позволяет определить серогруппу возбудителя холеры. На малой хромосоме, помимо генов с неустановленной функцией, локализованы структурные гены hlyA, отвечающие за синтез термолабильного гемолизина, а также остров интегронов, содержащий гены, кодирующие антибиотикоустойчивость, и участвующий в приобретении новых генов. Следует отметить, что ген hlуА присутствует в хромосоме всех штаммов V.cholerae, как способных к биосинтезу термолабильного гемолизина, так и не продуцирующих этот белок. Однако в гене hlуА холерных вибрионов классического биовара, в отличие от такового V.cholerae эльтор, имеется делеция протяженностью 11 п.н., вследствие чего продукция гемолизина вибрионами этого биовара невозможна.

Штаммы холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп, содержащие гены ctxAB и tcpA-F, вызывают холеру и являются эпидзначимыми. Эти штаммы не лизируют эритроциты барана в пробе Грейга. Эпидемически не значимые штаммы холерных вибрионов, не содержащие генов ctxAB и tcpA-F, лизируют эритроциты барана в пробе Грейга. Нетоксигенные (не содержащие гена холерного токсина) ctxАВ варианты холерных вибрионов O1, также как и других серогрупп, могут вызывать спорадические (единичные) или групповые (при общем источнике инфицирования) заболевания, не склонные к эпидемическому распространению.

Известна изменчивость холерных вибрионов по морфологии колоний и клеток, по образованию некультивируемых и Л-форм, по агглютинабельности диагностическими О, Инаба и Огава сыворотками (вплоть до полной утраты) и агглютинабельности RO сывороткой. Нередко сочетается изменчивость по культурально-морфологическим признакам, агглютинабельности холерными сыворотками и чувствительности к фагам.

Холерные вибрионы O1 и O139 серогрупп, как правило, чувствительны к набору антибактериальных препаратов. Однако широкое применение антибактериальных препаратов в очагах холеры способствовало увеличению резистентности холерных вибрионов к ним.

При проведении лабораторной диагностики холеры регламентируется использование зарегистрированных диагностических препаратов и тест-систем в соответствии с прилож. 4, позволяющих выявлять определённые фено- и генотипические признаки холерных вибрионов.

5. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального уровня

5.1. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий лечебно-профилактических учреждений

5.1.1. Требования к бактериологическим лабораториям лечебно-профилактических учреждений, осуществляющим диагностические исследования на холеру

Наличие разрешительных и регламентирующих работу документов

Лечебно-профилактические учреждения, лаборатории которых осуществляют диагностические исследования на холеру, должны иметь лицензию на осуществление деятельности, связанной с использованием возбудителей III - IV групп патогенности (опасности).

Лаборатории ЛПУ должны иметь санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) в соответствии с действующими санитарными правилами о порядке выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I - IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами.

Учет, хранение, передача и транспортирование выделенных культур холерных вибрионов (подозрительных) должны осуществляться в соответствии с действующими нормативными документами о порядке учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности.

Утилизация отходов должна осуществляться в соответствии с действующими санитарными правилами по сбору, хранению и удалению отходов лечебно-профилактических учреждений.

Проведение исследований на всех этапах: отбор проб, их хранение, доставка в лабораторию, регистрация, порядок исследования, выдача результатов, взаимодействие с учреждениями Роспотребнадзора должны соответствовать требованиям действующих нормативных и распорядительных документов.

Требования к специалистам и вспомогательному персоналу, участвующим в выполнении исследований на холеру

Исследования на холеру могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским, биологическим образованием, окончившие соответствующие курсы по специальности «Бактериология», имеющие допуск к работе с ПБА III - IV групп на основании приказа руководителя учреждения.

Специалисты должны повышать квалификацию не реже одного раза в пять лет и иметь сертификат специалиста.

Инженерно-технический персонал, дезинфекторы и санитарки проходят специальную подготовку по месту работы в соответствии с должностными обязанностями.

Необходимый уровень подготовки специалистов с высшим медицинским (биологическим) образованием и средним медицинским образованием, повышение их квалификации по лабораторной диагностике холеры представлен в прилож. 1.

Требования к знаниям и умениям специалистов ЛПУ, выполняющих бактериологические исследования на холеру, приведены в прилож. 2.

Требования к обеспечению безопасности работы персонала

Каждая бактериологическая лаборатория должна иметь пакет документов, определяющих режим безопасной работы сотрудников с учетом характера работ, особенностей технологии, свойств микроорганизмов. Документы должны быть согласованы с комиссией по контролю соблюдения требований биологической безопасности, специалистами по охране труда, противопожарным мероприятиям и утверждены руководителем учреждения. Результаты проверок знаний правил техники безопасности персонала при проведении работ фиксируются в специальном журнале.

Все сотрудники должны выполнять требования по обеспечению безопасности работы с материалом, подозрительным или зараженным возбудителями инфекционных болезней III - IV групп патогенности (опасности) в соответствии с действующими нормативными документами.

Порядок организации внутреннего контроля качества лабораторных исследований

Контроль качества диагностических исследований на холеру в лабораториях ЛПУ включает:

·      контроль качества питательных сред, диагностических препаратов, дистиллированной воды, химических реактивов и дезинфицирующих средств;

·      своевременную поверку средств измерений, аттестацию испытательного оборудования;

·      контроль качества стерилизации лабораторной посуды;

·      контроль работы паровых и суховоздушных стерилизаторов;

·      контроль работы бактерицидных ламп;

·      контроль температурного режима работы холодильников и термостатов;

·      проверку состояния воздуха производственных помещений и боксов, температурного режима, влажности;

·      проверку санитарного состояния помещений, включая условия уборки, дезинфекции, контроль смывов с поверхностей и оборудования.

Результаты контроля фиксируют в специальных журналах.

Правила ведения документации

Ведение лабораторной документации, включая регистрационные и рабочие журналы, осуществляют в соответствии с требованиями действующих нормативно-методических документов.

Требования к материальным ресурсам, необходимым для выполнения диагностических исследований на холеру

Для проведения диагностических исследований на холеру в лабораториях ЛПУ должны быть в наличии:

·      питательные среды, зарегистрированные в установленном порядке (прилож. 3, 8);

·      диагностические препараты, зарегистрированные в установленном порядке (прилож. 4, 8);

·      химические реактивы (прилож. 5);

·      приборы, оборудование, расходные материалы (прилож. 6).

5.1.2. Номенклатура и объем исследований

В лабораториях ЛПУ проводят диагностические исследования материала от лиц, подлежащих обследованию на холеру при проведении эпидемиологического надзора в соответствии с требованиями действующих санитарных правил по профилактике холеры, в периоды обследования дифференцированно для территорий, различных по типам эпидемических проявлений холеры.

В лабораториях ЛПУ проводят диагностические исследования материала в следующем объеме:

1) посев на среды накопления и дифференциально-диагностические, выделение культуры, подозрительной на холерный вибрион по морфологическим признакам;

2) идентификация культуры, подозрительной на холерный вибрион, по следующим тестам:

·      ферментация на полиуглеводной среде;

·      определение индофенолоксидазы;

·      микроскопия мазка, окрашенного по Граму;

·      слайд-агглютинация с холерными диагностическими сыворотками;

3) экспресс и ускоренная диагностика: методы МФА и РИВ (при исследовании материала с подозрением на холеру).

5.1.3. Порядок лабораторной диагностики холеры в лабораториях лечебно-профилактических учреждений

Отбор и транспортирование проб клинического материала

При проведении бактериологического анализа на холеру исследуется клинический материал: испражнения, рвотные массы, желчь и секционный материл от умерших, причиной смерти которых явились кишечные инфекции неустановленной этиологии.

Отбор, упаковка и транспортирование проб клинического материала для исследования осуществляются в соответствии с действующими методическими указаниями по лабораторной диагностике холеры.

Материал от больных забирает медицинский персонал ЛПУ немедленно при выявлении больного, до начала лечения антибиотиками. Кратность отбора проб - в соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими правилами по эпидемиологическому надзору за холерой.

В зависимости от времени забора материала и времени работы лаборатории пробы на исследование отбирают в соответствии со следующей схемой:

1. При круглосуточном режиме работы лаборатории материал забирают в нативном виде, в 5 - 10 мл 1 %-й пептонной воды рН 8,4 ± 0,1 (транспортная среда) или в 50 мл 1 %-й пептонной воды рН 8,4 ± 0,1 (1-я среда накопления);

2. При односменной работе лаборатории:

а) при взятии материала в 6.00 - 10.00 ч утра и доставке в бактериологическую лабораторию до 10 ч утра материал забирают в 5 - 10 мл 1 %-й пептонной воды (транспортная среда) или в 50 мл 1 %-й пептонной воды (1-я среда накопления);

б) при взятии материала после 10 ч утра и доставке в течение рабочего дня лаборатории материал забирают в 5 - 10 мл 1 %-й пептонной воды (транспортная среда);

в) при взятии материала по окончании рабочего дня лаборатории и доставке в лабораторию до 10 ч утра следующего рабочего дня материал забирают в 5 - 10 мл 1 %-й пептонной воды (транспортная среда);

г) при взятии материала в выходные дни лаборатории и доставке материала до 10 ч утра следующего рабочего дня материал забирают в 50 мл 1 %-й пептонной воды с теллуритом калия (транспортная среда).

Флаконы и пробирки с 1 %-й пептонной водой должны быть этикетированы с указанием названия среды и даты ее изготовления. При этом

1 %-я пептонная вода хранится при температуре не выше (10 ± 0,2) °С.

От больных тяжелой формой материал направляют в лабораторию нативным и в 1 %-й пептонной воде. В транспортную среду вносят 1 - 2 мл или 1 - 2 г материала на 5 - 6 мл среды.

Обильные водянистые испражнения и рвотные массы в количестве 10 - 20 мл отбирают из индивидуального судна в стерильные контейнеры объемом 60 - 100 мл стерильными ложками или автоматической пипеткой переменного объема.

У больных легкими формами - 1 - 2 г испражнений собирают в стерильный контейнер объемом 60 - 100 мл или петлю (зонд) ректальную стерильную смачивают стерильным физиологическим раствором и вводят в прямую кишку на глубину 5 - 6 см. Материал помещают в пробирку с транспортной средой.

Желчь берут при дуоденальном зондировании в лечебном учреждении. В отдельные полимерные контейнеры объемом 60 мл собирают две порции: из желчного пузыря и желчных протоков (В и С). Материал доставляют нативным.

Пробы маркируют, обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором, упаковывают в полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией, заполняют бланк-направление и помещают в контейнер (кейс) для транспортирования биологического материала на исследование.

При необходимости пробы сохраняют при комнатной температуре (24,0 ± 1,0 °С) в биксе, ящике, шкафу в специально выделенной комнате, закрывающейся на замок.

Исследование клинического материала

Профилактические исследования клинического материала на холеру проводят в течение рабочего дня, диагностические исследования материала от больного с подозрением на холеру, а также в случае выделения культуры, подозрительной на холерный вибрион - в условиях круглосуточного режима работы лаборатории с включением экспресс и ускоренных методов диагностики. При исследовании материала от больных холерой (подозрительных) среды накопления с ингибиторами не используются.

Методы исследования клинического материала на холеру в лабораториях ЛПУ: бактериологический и ускоренные (слайд-агглютинация, РИВ и МФА).

Все изолированные от людей культуры, подозрительные на холерные вибрионы, независимо от результатов слайд-агглютинации холерными сыворотками, передаются для дальнейшей идентификации в установленном порядке.

1. Исследование клинического материала на холеру при круглосуточном режиме работы лаборатории

I этап исследования

Посев нативного материала (испражнения, рвотные массы и др.) и материала, доставленного в транспортной среде, в первую жидкую среду накопления (1 %-ю пептонную воду) и на плотные питательные среды: щелочной агар и элективную среду типа TCBS.

Материал, доставленный в 5 мл 1 %-й пептонной воды полностью засевают в 50 мл среды накопления.

При доставке материала в 50 мл 1 %-й пептонной воды не позже 2 ч после забора, пробу помещают в термостат на 6 ч (первая среда накопления). При доставке в более поздние сроки 5 мл материала засевают в 50 мл 1 %-й пептонной воды.

Материал от лиц, принимавших антибиотики, активные по отношению к возбудителю холеры, засевают в большой объем жидкой накопительной среды (200 - 300 мл) и на 2 чашки щелочного агара. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 ч, производя высев через каждые 8 - 10 ч на пластинки щелочного агара. Вторую среду накопления при этом не используют.

Постановка ускоренных методов исследования с нативным материалом: МФА и РИВ.

При получении положительного результата в двух методах выдают устный предварительный положительный ответ по предусмотренной в учреждении схеме, в соответствии с действующими методическими указаниями по лабораторной диагностике холеры.

II этап исследования
(через 6 - 8 ч от начала исследования)

Высев с первой среды накопления на щелочной агар, элективную среду и во вторую среду накопления (1 %-ю пептонную воду).

Постановка ускоренных методов исследования с материалом из I среды накопления при отрицательных результатах в МФА и РИВ на I этапе исследования.

Выдача устного предварительного положительного ответа при положительном результате в двух методах по предусмотренной схеме.

III этап исследования
(через 12 - 16 ч от начала исследования)

Высев из второй среды накопления на щелочной агар.

Просмотр посевов на щелочном агаре, засеянных на I этапе исследования, в косо проходящем свете стереоскопического микроскопа.

Производят отбор подозрительных колоний на полиуглеводную среду и щелочной или другой питательный агар для накопления культур.

При наличии достаточного количества подозрительных колоний ставят следующие тесты:

·      определение индофенолоксидазы;

·      микроскопия мазка, окрашенного по Граму;

·      слайд-агглютинация с сыворотками холерными O1 серогруппы (при положительном результате - с Инаба, Огава), RO, при отрицательном результате - с сывороткой O139 серогруппы;

·      постановка МФА, РИВ.

Выдача устного предварительного положительного ответа при положительном результате в двух методах (наличие индофенолоксидазы, положительный результат слайд-агглютинации, МФА или РИВ) по предусмотренной схеме.

IV этап исследования
(через 18 - 24 ч от начала исследования)

Просмотр посевов на щелочном агаре и на элективной среде, сделанных на I - II этапах исследования в косо проходящем свете стереоскопического микроскопа.

Отбор колоний, подозрительных на колонии холерных вибрионов, постановка тестов, предусмотренных на III этапе исследования.

Отсев подозрительных на холерные вибрионы колоний на одну из полиуглеводных сред и щелочной агар для накопления культуры.

Выдача устного предварительного положительного ответа об обнаружении в исследуемом материале культур, подозрительных на холерные вибрионы O1, RO или O139 серогруппы на основании результатов следующих тестов:

·      характерные морфологические и культуральные признаки;

·      положительный тест на индофенолоксидазу;

·      положительная реакция слайд-агглютинации с соответствующими холерными диагностическими сыворотками;

·      положительные результаты ускоренной диагностики методами МФА и РИВ.

V этап исследования
(через 24 - 36 ч от начала исследования)

Отбор культур с характерным ростом на полиуглеводной среде и щелочном агаре, постановка тестов, предусмотренных на III этапе исследования.

Выдача устного предварительного положительного ответа об обнаружении в исследуемом материале культур, подозрительных на холерные вибрионы O1, RO или O139 серогруппы на основании результатов следующих тестов:

·      характерные морфологические и культуральные признаки;

·      положительный тест на индофенолоксидазу;

·      положительная реакция слайд-агглютинации с соответствующими холерными диагностическими сыворотками;

·      положительные результаты ускоренной диагностики методами МФА и РИВ.

Подготовка выделенной культуры к транспортированию.

Передача выделенной культуры для идентификации в установленном порядке.

2. Исследование клинического материала на холеру при односменной работе лаборатории

В течение рабочей недели для отбора проб используют 1 %-ю пептонную воду без теллурита калия в объеме 5-10 мл (транспортная среда) или 50 мл (среда накопления).

В качестве 1-й или 2-й среды накопления используют 1 %-ю пептонную воду (рН 8,4 ± 0,1) с теллуритом калия в конечной концентрации 1:100000 - 1:200000 в соответствии с результатами его контроля.

1-й вариант. Клинический материал поступил в лабораторию до 10 ч утра. Время взятия материала - 6.00 - 10.00 ч утра

I этап исследования

а) материал доставлен в транспортной среде (5 - 10 мл 1 %-й пептонной воды) или нативным (испражнения, рвотные массы и др.).

Посев материала в 50 мл 1 %-й пептонной воды - 1-я среда накопления. Кроме того, нативный материал засевают на плотные питательные среды: щелочной агар и элективную среду типа TCBS.

б) материал доставлен не позже 2 ч после забора в 50 мл 1 %-й пептонной воды. Помещают в термостат на инкубацию как 1-ю среду накопления.

II этап исследования
через 6 ч (в течение 1-го рабочего дня)

Пересев с 1-й среды накопления во 2-ю среду накопления с теллуритом калия и высев на щелочной агар и элективную среду типа TCBS.

III этап исследования
через 24 - 26 ч от начала исследования (в начале 2-го рабочего дня)

Высев со 2-й среды накопления на щелочной агар и элективную среду типа TCBS.

Просмотр посевов на щелочном агаре и элективной среде, засеянных на I и II этапах исследования, в косо проходящем свете стереоскопического микроскопа.

Отсев колоний, подозрительных на колонии холерных вибрионов, на одну из полиуглеводных сред и щелочной агар для накопления культуры.

При достаточном количестве подозрительные на холерные вибрионы колонии изучают с использованием следующих тестов:

·      определение индофенолоксидазы;

·      микроскопия мазка, окрашенного по Граму;

·      слайд-агглютинация с сыворотками холерными O1 серогруппы (при положительном результате - с Инаба, Огава), RO и O139 серогруппы.

Выдача устного предварительного положительного ответа об обнаружении в исследуемом материале культур, подозрительных на холерные вибрионы O1, RO или O139 серогруппы на основании результатов следующих тестов:

·      характерные морфологические и культуральные признаки;

·      положительный тест на индофенолоксидазу;

·      положительная реакция слайд-агглютинации с соответствующими колерными диагностическими сыворотками.

IV этап исследования
через 48 - 50 ч от начала исследования (в течение 3-го рабочего дня)

Отбор культур с характерным ростом на полиуглеводной среде и щелочном агаре, постановка тестов, предусмотренных на III этапе исследования.

Просмотр посевов на щелочном агаре и элективной среде, сделанных на I - III этапах исследования, в косо проходящем свете стереоскопического микроскопа.

Отбор со щелочного агара и элективной среды подозрительных на холерные вибрионы колоний на одну из полиуглеводных сред и щелочной агар для накопления культуры.

Подозрительные на холерные вибрионы колонии изучают с использованием следующих тестов:

·      определение индофенолоксидазы;

·      микроскопия мазка, окрашенного по Граму;

·      слайд-агглютинация с сыворотками холерными O1 серогруппы (при положительном результате - с Инаба, Огава), RO и O139 серогруппы.

Выдача предварительного положительного ответа об обнаружении в исследуемом материале культур, подозрительных на холерные вибрионы O1, RO или O139 серогруппы на основании результатов следующих тестов:

·      характерные морфологические и культуральные признаки;

·      положительный тест на индофенолоксидазу;

·      положительная реакция слайд-агглютинации с соответствующими холерными диагностическими сыворотками.

V этап исследования
через 72 - 74 ч (в течение 4-го рабочего дня)

Отбор культур с характерным ростом на полиуглеводной среде и щелочном агаре и изучение их по тестам, указанным для IV этапа исследования.

Подготовка выделенной культуры к транспортированию. Передача выделенной культуры для дальнейшей идентификации в установленном порядке возможна на любом этапе.

2-й вариант. Клинический материал поступил после 10 ч утра, в течение рабочего дня лаборатории. Время взятия материала - 10.00 - до конца рабочего дня лаборатории

Материал доставлен в транспортной среде (5 - 10 мл 1 %-й пептонной воды).

I этап исследования
(в течение 1-го рабочего дня)

Посев 5 - 10 мл транспортной среды с материалом в 50 мл 1 %-й пептонной воды с теллуритом калия - 1-я среда накопления и высев на щелочной агар и элективную среду типа TCBS.

II этап исследования
через 24 - 26 ч от начала исследования (в начале 2-го рабочего дня)

Высев с 1-й среды накопления во 2-ю среду накопления без теллурита калия, на щелочной агар и элективную среду типа TCBS.

Просмотр в косо проходящем свете стереоскопического микроскопа посевов на щелочном агаре и элективной среде, сделанных на I этапе исследования.

Отсев подозрительных на холерные вибрионы колоний на полиуглеводную среду и щелочной или другой питательный агар для накопления культуры.

Подозрительные на холерные вибрионы колонии изучают с использованием следующих тестов:

·      определение индофенолоксидазы;

·      микроскопия мазка, окрашенного по Граму;

·      слайд-агглютинация с сыворотками холерными O1 серогруппы (при положительном результате - с Инаба, Огава), RO и O139 серогруппы.

Выдача предварительного положительного ответа об обнаружении в исследуемом материале культур, подозрительных на холерные вибрионы O1, RO или O139 серогруппы на основании результатов следующих тестов:

·      характерные морфологические и культуральные признаки;

·      положительный тест на индофенолоксидазу;

·      положительная реакция слайд-агглютинации с соответствующими холерными диагностическими сыворотками.

III этап исследования
через 30 - 32 ч от начала исследования (в конце 2-го рабочего дня)

Высев через 6 ч инкубации со 2-й среды накопления на щелочной агар.

IV этап исследования
через 48 - 50 ч от начала исследования (в течение 3-го рабочего дня)

Отбор культур с характерным ростом на полиуглеводной среде и щелочном агаре, постановка тестов, предусмотренных на II этапе исследования.

Просмотр в косо проходящем свете стереоскопического микроскопа посевов на щелочном агаре и элективной среде, сделанных на II и III этапах исследования.

Отсев подозрительных на холерные вибрионы колоний на полиуглеводную среду и щелочной или другой питательный агар для накопления культуры.

Подозрительные на холерные вибрионы колонии изучают с использованием следующих тестов:

определение индофенолоксидазы;

микроскопия мазка, окрашенного по Граму;

слайд-агглютинация с сыворотками холерными O1 серогруппы (при положительном результате - с Инаба, Огава), RO и O139 серогруппы.

Выдача устного предварительного положительного ответа об обнаружении в исследуемом материале культур, подозрительных на холерные вибрионы O1, RO или O139 серогруппы на основании результатов следующих тестов:

·      характерные морфологические и культуральные признаки;

·      положительный тест на индофенолоксидазу;

·      положительная реакция слайд-агглютинации с соответствующими холерными диагностическими сыворотками.

V этап исследования
через 72 - 74 ч (в течение 4-го рабочего дня)

Отбор культур с характерным ростом на полиуглеводной среде и щелочном агаре.

Изучение по тестам, предусмотренным на IV этапе.

Подготовка выделенной культуры к транспортированию. Передача выделенной культуры для дальнейшей идентификации в установленном порядке возможна на любом этапе.

3-й вариант. Время взятия материала - по окончании рабочего дня лаборатории. Клинический материал доставлен в лабораторию до 10 ч утра следующего рабочего дня

I этап исследования
(1-й рабочий день)

Материал доставлен в транспортной среде (5 - 10 мл 1 %-й пептонной воды без теллурита калия).

Посев материала в 50 мл 1 %-й пептонной воды (1-я среда накопления), на щелочной агар и элективную среду типа TCBS.

II этап исследования
через 6 ч от начала исследования (в течение 1-го рабочего дня)

Пересев с 1-й среды накопления во 2-ю среду накопления (1 %-я пептонная вода с теллуритом калия), высев на щелочной агар и элективную среду типа TCBS.

III этап исследования
через 24 - 26 ч от начала исследования (в начале 2-го рабочего дня)

Высев со 2-й среды накопления на щелочной агар.

Просмотр в косо проходящем свете стереоскопического микроскопа посевов на щелочном агаре и элективной среде, засеянных на I и II этапах исследования.

Отсев подозрительных на холерные вибрионы колоний на полиуглеводную среду и на щелочной или другой питательный агар для накопления культуры.

Подозрительные на холерные вибрионы колонии изучают с использованием следующих тестов:

·      микроскопия мазка, окрашенного по Граму;

·      определение индофенолоксидазы;

·      слайд-агглютинация с сыворотками холерными O1 серогруппы (при положительном результате - с Инаба, Огава), RO и O139 серогруппы.

При положительном результате в двух методах - выдача устного предварительного положительного ответа по предусмотренной схеме.

IV этап исследования
через 48 - 50 ч от начала исследования (в течение 3-го рабочего дня)

Отбор культур с характерным ростом на полиуглеводной среде и щелочном агаре, постановка тестов, предусмотренных на III этапе исследования.

Просмотр в косо проходящем свете стереоскопического микроскопа посевов на щелочном агаре и элективной среде.

Отсев на полиуглеводную среду и щелочной или другой питательный агар для накопления культуры, подозрительной на холерные вибрионы.

Определение индофенолоксидазы.

Микроскопия мазка, окрашенного по Граму.

Слайд-агглютинация с сыворотками холерными O1 серогруппы (при положительном результате - с Инаба, Огава), RO и O139 серогруппы.

Выдача предварительного положительного ответа об обнаружении в исследуемом материале культур, подозрительных на холерные вибрионы O1, RO или O139 серогруппы на основании результатов следующих тестов:

·      характерные морфологические и культуральные признаки;

·      положительный тест на индофенолоксидазу;

·      положительная реакция слайд-агглютинации с соответствующими холерными диагностическими сыворотками.

V этап исследования
через 72 - 74 ч от начала исследования (в течение 4-го рабочего дня)

Отбор культур с характерным ростом на полиуглеводной среде и щелочном агаре. Изучение культур по тестам предыдущего этапа. Подготовка выделенной культуры к транспортированию. Передача выделенной культуры для дальнейшей идентификации в установленном порядке возможна на любом этапе.

4-й вариант. Время взятия материала - выходные дни лаборатории. Клинический материал поступил до 10 ч утра следующего рабочего дня

I этап исследования (1-й рабочий день)

Материал доставлен в транспортной среде (50 мл 1 %-й пептонной воды с теллуритом калия).

Посев 5 - 10 мл среды с материалом в 50 мл 1 %-й пептонной воды - 1-я среда накопления.

II этап исследования
через 6 ч от начала исследования (в течение 1-го рабочего дня)

Пересев с 1-й среды накопления во 2-ю среду накопления (1 %-я пептонная вода с теллуритом калия), высев на щелочной агар и элективную среду типа TCBS.

III этап исследования
через 24 - 26 ч от начала исследования (в начале 2-го рабочего дня)

Высев со 2-й среды накопления на щелочной агар.

Просмотр в косо проходящем свете стереоскопического микроскопа посевов на щелочном агаре и элективной среде типа TCBS.

Отсев колоний, подозрительных на колонии холерного вибриона, на полиуглеводную среду и щелочной или другой питательный агар для накопления культуры.

При достаточном количестве подозрительных на холерные вибрионы колоний ставят тесты:

·      определение индофенолоксидазы;

·      микроскопия мазка, окрашенного по Грамму;

·      слайд-агглютинация с сыворотками холерными O1 серогруппы (при положительном результате - с Инаба, Огава), RO и O139 серогруппы.

Выдача устного предварительного положительного ответа по предусмотренной схеме.

IV этап исследования
через 48 - 50 ч от начала исследования (в течение 3-го рабочего дня)

Отбор культур с характерным ростом на полиуглеводной среде и щелочном агаре, постановка тестов, предусмотренных на III этапе исследования.

Просмотр посевов в косо проходящем свете стереоскопического микроскопа на щелочном агаре и на элективной среде, засеянных на II и III этапах исследования.

Отсев колоний, подозрительных на колонии холерного вибриона, на полиуглеводную среду и на щелочной или другой питательный агар для накопления культуры.

Определение индофенолоксидазы.

Микроскопия мазка, окрашенного по Граму.

Слайд-агглютинация с сыворотками холерными O1 серогруппы (при положительном результате - с Инаба, Огава), RO и O139 серогруппы.

Выдача предварительного положительного ответа по предусмотренной схеме.

V этап исследования
через 72 - 74 ч от начала исследования (в течение 4-го рабочего дня)

Отбор культур с характерным ростом на полиуглеводной среде и щелочном агаре.

Изучение культуры по тестам, предусмотренным на IV этапе. Передача выделенной культуры для дальнейшей идентификации в установленном порядке возможна на любом этапе.

5.1.4. Оформление результатов исследования

Регистрация результатов анализа в лаборатории ЛПУ производится по учетным формам в соответствии с действующими МУК по лабораторной диагностике холеры. Выдача ответов для историй болезней - по унифицированным формам.

5.1.5. Порядок взаимодействия лечебно-профилактических учреждений с учреждениями Роспотребнадзора

Информация о выделенной в лаборатории ЛПУ культуре холерного вибриона передается в соответствии со схемой выдачи результатов исследований (прилож. 9).

Культуры холерных вибрионов направляют в лаборатории ООИ ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте, при ее отсутствии в лаборатории Регионального центра по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности или Центра индикации и диагностики опасных инфекционных болезней (территориальное противочумное учреждение). Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с действующими санитарными правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности.

5.2. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для филиалов ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации

5.2.1. Требования к лабораториям филиалов ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации, осуществляющим бактериологические исследования на холеру

Наличие разрешительных и регламентирующих работу документов

ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте, на базе филиалов которого функционируют бактериологические лаборатории, должен иметь лицензию на осуществление деятельности, связанной с использованием возбудителей III-IV групп патогенности (опасности).

Бактериологические лаборатории филиалов ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании в субъекте Российской Федерации должны иметь санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) в соответствии с действующими санитарными правилами о порядке выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных болезней человека I - IV групп патогенности (опасности).

Лаборатории филиалов ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании в субъекте Российской Федерации должны быть аккредитованы на техническую компетентность в установленном порядке в соответствии с действующей законодательной базой Российской Федерации.

Учет, хранение, передача и транспортирование выделенных культур, подозрительных на холерные вибрионы, должны осуществляться в соответствии с действующими санитарными правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности.

Утилизация отходов должна осуществляться в соответствии с действующими санитарными правилами по санитарно-эпидемиологическим требованиям к обращению с медицинскими отходами.

Проведение исследований на всех этапах: отбор проб, их хранение, доставка в лабораторию, регистрация, порядок исследования, выдача результатов, взаимодействие с учреждениями Роспотребнадзора должны соответствовать требованиям действующих нормативных и распорядительных документов.

Требования к специалистам и персоналу, участвующим в выполнении исследований на холеру

Исследования на холеру могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским, биологическим образованием, окончившие курсы по специальности «Бактериология», имеющие допуск к работе с ПБА III - IV групп на основании приказа руководителя учреждения.

Инженерно-технический персонал, дезинфекторы и санитарки проходят специальную подготовку по месту работы в соответствии с должностными обязанностями.

Специалисты, осуществляющие деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных болезней, должны повышать квалификацию не реже одного раза в 5 лет и иметь сертификат специалиста.

Необходимый уровень подготовки специалистов с высшим медицинским (биологическим) образованием и средним медицинским образованием, и повышение их квалификации по лабораторной диагностике холеры представлены в прилож. 1.

Требования к знаниям и умениям специалистов, выполняющих бактериологические исследования на холеру, приведены в прилож. 2.

Требования к обеспечению безопасности работы персонала

Каждая лаборатория должна иметь пакет документов, определяющих режим безопасной работы сотрудников с учетом характера работ, особенностей технологии, свойств микроорганизмов. Документы должны быть согласованы с комиссией по контролю соблюдения требований биологической безопасности, специалистами по охране труда, противопожарным мероприятиям и утверждены руководителем учреждения. Результаты проверок знаний правил техники безопасности персонала при проведении работ фиксируются в специальном журнале.

Все сотрудники должны выполнять требования по обеспечению безопасности работы с материалом, подозрительным или зараженным возбудителями инфекционных болезней III - IV групп патогенности (опасности) в соответствии с действующими нормативными документами.

Порядок организации внутреннего контроля качества лабораторных исследований

Контроль качества диагностических исследований на холеру в лабораториях филиалов ФБУЗ ЦГиЭ в субъекте Российской Федерации включает:

·      контроль качества питательных сред, диагностических препаратов и тест-систем, дистиллированной воды, дезинфицирующих средств, химических реактивов;

·      своевременную поверку средств измерений, аттестацию испытательного оборудования;

·      контроль качества стерилизации фильтровальных установок, лабораторной посуды;

·      контроль качества стерилизации паровых и суховоздушных стерилизаторов;

·      контроль работы бактерицидных ламп;

·      контроль температурного режима работы холодильников и термостатов;

·      проверку состояния воздуха производственных помещений и боксов, температурного режима, влажности;

·      проверку санитарного состояния помещений, включая условия уборки, дезинфекции, контроль смывов с поверхностей и оборудования.

Результаты контроля фиксируют в специальных журналах.

Правила ведения документации

Ведение лабораторной документации, включая регистрационные и рабочие журналы, осуществляют в соответствии с требованиями действующих методических документов.

Требования к материальным ресурсам, необходимым для выполнения диагностических исследований на холеру

Для проведения диагностических исследований на холеру в лабораториях должны быть в наличии:

·      питательные среды, зарегистрированные в установленном порядке и прошедшие контроль качества (прилож. 3, 8);

·      диагностические препараты и тест-системы, зарегистрированные в установленном порядке (прилож. 4, 8);

·      химические реактивы (прилож. 5);

·      приборы, оборудование, расходные материалы (прилож. 6).

5.2.2. Номенклатура и объем исследований

Лаборатории филиалов ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании в субъекте Российской Федерации при осуществлении эпидемиологического надзора проводят плановые профилактические исследования на холеру в сроки, определённые для территорий, различных по типам эпидемических проявлений холеры, в действующих санитарных правил:

·      материала от лиц, подлежащих лабораторному обследованию;

·      проб из объектов окружающей среды.

В лабораториях филиалов ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании, (городе, административном районе) в субъекте проводят диагностические исследования материала в следующем объеме:

1) посев на среды накопления и дифференциально-диагностические, выделение культуры, подозрительной на возбудителя холеры;

2) идентификация культуры, подозрительной на возбудителя холеры, по следующим тестам:

·      микроскопия мазка, окрашенного по Граму;

·      выявление индофенолоксидазы;

·      слайд-агглютинация с холерными диагностическими сыворотками;

3) экспресс и ускоренная диагностика: методы МФА и РИВ.

5.2.3. Порядок лабораторной диагностики холеры в лабораториях филиалов ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации

5.2.3.1. Порядок исследования клинического материала

1. Отбор проб клинического материала

При проведении бактериологического анализа на холеру исследуется клинический материал: испражнения, рвотные массы, желчь.

Отбор, упаковка проб клинического материала для исследования, транспортирование, форма направления - в соответствии с действующими МУК по лабораторной диагностике холеры.

Материал от больных с дисфункцией кишечника забирает медицинский персонал ЛПУ в соответствии с разделом 5.1.3.

2. Исследование клинического материала

Методы исследования клинического материала на холеру в лабораториях филиалов ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальных образованиях (городах и административных районах субъекта, объединенных по территориальному признаку)»: бактериологический и ускоренные (слайд-агглютинация, МФА и РИВ).

Профилактические исследования клинического материала на холеру проводят в течение рабочего дня, диагностические исследования материала от больного с подозрением на холеру, а также в случае выделения культуры, подозрительной на холерный вибрион - в условиях круглосуточного режима работы лаборатории с включением экспрессных и ускоренных методов диагностики. При исследовании материала от больных холерой (подозрительных) среды накопления с ингибиторами не используются.

Порядок исследования материала от лиц, подлежащих обследованию при эпидемиологическом надзоре за холерой, при круглосуточной работе лаборатории осуществляется в соответствии с изложенным в п. 5.1.3 (1. Исследование клинического материала на холеру при круглосуточном режиме работы лаборатории).

Порядок исследования на холеру материала от лиц, подлежащих обследованию при эпидемиологическом надзоре, при односменной работе лаборатории осуществляется в зависимости от времени забора и доставки материала в лабораторию - варианты 1 - 4, изложенные в п. 5.1.3 (2. Исследование клинического материала при осуществлении эпидемиологического надзора за холерой при односменной работе лаборатории).

Все изолированные от людей культуры, подозрительные на холерные вибрионы, независимо от результатов слайд-агглютинации холерными сыворотками, передаются для дальнейшей идентификации в установленном порядке.

Регистрация результатов анализа и выдача ответов производится по учетным формам, предусмотренным в действующих методических указаниях по лабораторной диагностике холеры.

5.2.3.2. Порядок исследования на холеру проб из объектов окружающей среды

1. Отбор и транспортирование проб из объектов окружающей среды

Отбор и доставка для исследования проб воды из поверхностных водоёмов, хозяйственно-бытовых и сточных вод, содержимого выгребных туалетов, ила, гидробионтов, мух, смывов с объектов окружающей среды, пищевых продуктов и другие, и форма направления - в соответствии с действующими методическими указаниями по лабораторной диагностике холеры.

2. Исследование проб воды из поверхностных водоемов

I этап исследования

Посевы проб воды из поверхностных водоемов с целью первичного накопления холерных вибрионов в зависимости от времени доставки (варианты).

1-й вариант - к пробе воды добавляют раствор основного пептона до 1 %-й концентрации; определяют рН; подщелачивают 10 %-м раствором едкого натра до рН 8,4 ± 0,1 (1-я среда накопления). Время инкубации в 1-й среде накопления - 8 - 10 ч.

2-й вариант - в воду добавляют раствор основного пептона до 1 %-й концентрации и теллурит калия из рабочего разведения 1:1000 до конечной концентрации 1:100000 или 1:200000 в соответствии с результатами его контроля; устанавливают рН 8,4 ± 0,1 (1-я среда накопления). Время инкубации в 1-й среде накопления - 18 - 24 ч.

3-й вариант - производят фильтрование воды через мембранные фильтры № 2 или 3, смыв с фильтров сеют в 1-ю среду накопления (1 %-я пептонная вода рН 8,4 ± 0,1) и на щелочной агар.

II этап исследования

1-й вариант - через 8 - 10 ч от начала исследования:

·      пересев с 1-й среды накопления во 2-ю (1 %-ю пептонную воду с теллуритом калия и без него; при этом время инкубации в среде без теллурита калия - 6 ч, а с теллуритом калия - 18 - 20 ч) и на щелочной агар.

2-й вариант - через 18 - 24 ч от начала исследования:

·      пересев с 1-й среды накопления во 2-ю (1 %-ю пептонную воду без теллурита калия; при этом время инкубации в среде без теллурита калия - 6 - 8 ч) и на щелочной агар.

3-й вариант - через 12 - 18 ч от начала исследования:

·      пересев с 1-й среды накопления во 2-ю среду накопления и на щелочной агар.

При интенсивном бактериальном загрязнении проб используют 3-ю среду накопления.

III этап исследования

Высев со 2-й среды накопления на щелочной агар.

IV этап исследования

Отбор колоний, подозрительных на колонии холерного вибриона, со щелочного агара в косо проходящем свете стереоскопического микроскопа.

Отсев колоний, подозрительных на колонии холерного вибриона, на одну из полиуглеводных сред и щелочной агар для накопления чистой культуры.

В случае проведения срочного анализа и при достаточном количестве подозрительных колоний:

·      определение индофенолоксидазы;

·      микроскопия мазка, окрашенного по Граму;

·      слайд-агглютинация с сыворотками холерными O1 серогруппы (при положительном результате - с Инаба, Огава), RO, O139 серогруппы;

·      возможно использование методов МФА и РИВ.

В этом случае выдача устного предварительного положительного ответа по предусмотренной схеме об обнаружении в исследуемых пробах культур, подозрительных на холерные вибрионы O1, RO или O139 серогруппы, на основании результатов следующих тестов:

·      характерные морфологические и культуральные признаки;

·      положительный тест на индофенолоксидазу;

·      положительная реакция слайд-агглютинации с соответствующими холерными диагностическими сыворотками;

·      положительные результаты ускоренной диагностики методами МФА и РИВ.

V этап исследования

Отбор культуры с характерным ростом на полиуглеводной среде и щелочном агаре.

Определение индофенолоксидазы.

Микроскопия мазка, окрашенного по Граму.

Слайд-агглютинация с сыворотками холерными O1 серогруппы (при положительном результате - с Инаба, Огава), RO, O139 серогруппы.

Возможно использование методов МФА и РИВ.

Выдача устного предварительного положительного ответа по предусмотренной схеме об обнаружении в исследуемых пробах культур, подозрительных на холерные вибрионы O1, RO или O139 серогруппы, на основании результатов следующих тестов:

·      характерные морфологические и культуральные признаки;

·      положительный тест на индофенолоксидазу;

·      положительная реакция слайд-агглютинации с соответствующими холерными диагностическими сыворотками;

·      положительные результаты ускоренной диагностики методами МФА и РИВ.

Подготовка выделенной культуры к транспортированию.

Срочная передача выделенной культуры для дальнейшей идентификации в установленном порядке.

Неагглютинирующиеся холерными сыворотками O1 серогруппы, RO и O139 серогруппы культуры идентифицируют на месте по биохимическим признакам с целью уточнения родовой и видовой принадлежности или по согласованию передают в лабораторию ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии».

3. Исследование хозяйственно-бытовых сточных вод

Подготовка проб сточной воды. Фильтрация сточной воды (1 л) через фильтр для освобождения от механических примесей (при необходимости).

При заборе сточных вод марлевыми тампонами, их помещают в емкости с накопительной средой (1 %-й раствор пептона); устанавливают рН 8,4 ± 0,1 (1-я среда накопления). Время инкубации 1-й среды накопления - 8 - 10 ч, в случае добавления теллурита калия - 18 - 24 ч.

Далее этапы исследования хозяйственно-бытовых сточных вод осуществляются в соответствии с изложенными в п. 5.2.3.2 пп. 2 (Порядок исследования проб воды из поверхностных водоемов).

5.2.4. Оформление результатов исследования

Регистрация результатов анализа в лабораториях филиалов ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании в субъекте Российской Федерации производится по учетным формам в соответствии с действующими методическими указаниями по лабораторной диагностике холеры.

5.2.5. Порядок взаимодействия филиалов ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации с учреждениями Роспотребнадзора

Информация о культуре холерного вибриона, выделенной в лаборатории филиала ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании в субъекте Российской Федерации из объектов окружающей среды передаётся в соответствии со схемой выдачи результатов исследований на холеру (прилож. 10).

Культура холерного вибриона направляется в лабораторию ООИ ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации, а при ее отсутствии в Региональный центр по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности или Центр индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней (региональное противочумное учреждение). Доставку осуществляют в соответствии с действующими СП по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности.

5.3. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации

5.3.1. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации, в структуре которых отсутствуют отделы и лаборатории особо опасных инфекций

Лаборатории ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъектах Российской Федерации, в структуре которых отсутствуют отделы и лаборатории особо опасных инфекций (имеющие санитарно-эпидемиологическое заключение на право работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности), при осуществлении эпидемиологического надзора за холерой проводят плановые профилактические исследования на холеру материала от лиц, подлежащих обследованию, и проб из объектов окружающей среды до этапа выделения культуры в следующем объеме:

1. Посев на среды накопления и элективную среду типа TCBS, выделение культуры, подозрительной на холерный вибрион;

2. Идентификация культуры, подозрительной на холерный вибрион, по следующим тестам:

·      микроскопия мазка, окрашенного по Граму;

·      выявление индофенолоксидазы;

·      слайд-агглютинация с холерными диагностическими сыворотками;

3. Экспресс и ускоренная диагностика: методы МФА и РИВ.

Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъектах Российской Федерации, в структуре которых отсутствуют отделы или лаборатории особо опасных инфекций, соответствует порядку для лабораторий филиалов ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальных образованиях в субъектах Российской Федерации (раздел 5.2).

5.3.2. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий особо опасных инфекций ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации

5.3.2.1. Требования к лабораториям особо опасных инфекций ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации, осуществляющим бактериологические исследования на холеру

Наличие разрешительных и регламентирующих работу документов

ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации, на базе которого функционируют лаборатории ООИ, должны иметь лицензию на осуществление деятельности, связанной с использованием возбудителей II - IV групп патогенности (опасности).

Лаборатории ООИ должны иметь санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с микроорганизмами II - IV групп патогенности (опасности) в соответствии с действующими санитарными правилами о порядке выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I - IV групп патогенности (опасности).

Лаборатории ООИ ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации должны быть аккредитованы на техническую компетентность в установленном порядке в соответствии с действующей законодательной базой Российской Федерации.

Учет, хранение, передача и транспортирование выделенных культур холерных вибрионов должны осуществляться в соответствии с действующими санитарными правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности.

Утилизация отходов должна осуществляться в соответствии с действующими санитарными правилами по санитарно-эпидемиологическим требованиям к обращению с медицинскими отходами.

Проведение исследований на всех этапах: отбор проб, их хранение, доставка в лабораторию, регистрация, порядок исследования, выдача результатов, взаимодействие с учреждениями Роспотребнадзора должны соответствовать требованиям, действующих нормативных и распорядительных документов.

Требования к специалистам и персоналу, участвующим в выполнении исследований на холеру

Исследования на холеру могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским, биологическим образованием, окончившие курсы специализации по особо опасным инфекциям, имеющие допуск к работе с ПБА II - IV групп на основании приказа руководителя учреждения.

Инженерно-технический персонал, дезинфекторы и санитарки проходят специальную подготовку по месту работы в соответствии с должностными обязанностями.

Специалисты, осуществляющие деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных болезней, должны повышать квалификацию не реже одного раза в 5 лет и иметь сертификат специалиста.

Необходимый уровень подготовки специалистов с высшим медицинским (биологическим) образованием и средним медицинским образованием, повышение их квалификации по лабораторной диагностике холеры представлен в прилож. 1.

Требования к знаниям и умениям специалистов лаборатории ООИ ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии», выполняющих бактериологические исследования на холеру, приведены в прилож. 2.

Требования к обеспечению безопасности работы персонала

Каждая лаборатория должна иметь пакет документов, определяющих режим безопасной работы сотрудников с учетом характера работ, особенностей технологии, свойств микроорганизмов. Документы должны быть согласованы с комиссией по контролю требований биологической безопасности, специалистами по охране труда, противопожарным мероприятиям и утверждены руководителем учреждения. Результаты проверок знаний правил техники безопасности персонала при проведении работ фиксируются в специальном журнале.

Все сотрудники должны выполнять требования по обеспечению безопасности работы с материалом, подозрительным и зараженным возбудителями инфекционных болезней II - IV групп патогенности (опасности), в соответствии с действующими нормативными документами.

Порядок организации внутреннего контроля качества лабораторных исследований

Контроль качества диагностических исследований на холеру в лабораториях ООИ ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» включает:

·      контроль качества питательных сред, диагностических препаратов и тест-систем, эталонных штаммов, дисков с антибактериальными препаратами, дистиллированной воды, дезинфицирующих средств, химических реактивов;

·      контроль эффективности мембранных фильтров;

·      своевременную поверку средств измерений, аттестацию испытательного оборудования;

·      контроль качества стерильности фильтровальных установок, лабораторной посуды;

·      контроль качества стерилизации паровых и суховоздушных стерилизаторов;

·      контроль работы бактерицидных ламп;

·      контроль температурного режима работы холодильников и термостатов;

·      проверку состояния воздуха производственных помещений и боксов, температурного режима, влажности;

·      проверку санитарного состояния помещений, включая условия уборки, дезинфекции, контроль смывов с поверхностей и оборудования.

Результаты контроля фиксируют в специальных журналах.

Правила ведения документации

Ведение лабораторной документации, включая регистрационные и рабочие журналы, осуществляют в соответствии с требованиями действующих нормативно-методических документов.

Требования к материальным ресурсам, необходимым для выполнения диагностических исследований на холеру

Для проведения диагностических исследований на холеру в лабораториях должны быть в наличии:

·      питательные среды, зарегистрированные в установленном порядке (прилож. 3, 8);

·      диагностические препараты, тест-системы, антибактериальные препараты, зарегистрированные в установленном порядке (прилож. 4, 7, 8);

·      химические реактивы (прилож. 5);

·      приборы, оборудование, расходные материалы (прилож. 6).

5.3.2.2. Номенклатура и объем исследований

Лаборатории ООИ ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъектах Российской Федерации, проводят:

·      исследование материала от больных и умерших с подозрением на холеру;

·      профилактические исследования материала от лиц, подлежащих обследованию на холеру в соответствии с требованиями эпиднадзора (по согласованию);

·      исследования проб из объектов окружающей среды;

·      идентификацию культур холерных вибрионов по полной схеме с определением эпидемической значимости в ПЦР по наличию генов ctxA и tcpA и антибиотикограммы диско-диффузионным методом;

·      контроль качества питательных сред.

5.3.2.3. Порядок диагностических исследований на холеру в лабораториях особо опасных инфекций ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации

Порядок исследования клинического материала осуществляется в соответствии с изложенным в п. 5.2.3.1.

Порядок бактериологического анализа на холеру проб из объектов окружающей среды соответствует п. 5.2.3.2.

В порядок бактериологического исследования на холеру (клинического материала и проб из объектов окружающей среды) дополнительно включены тесты идентификации культур холерных вибрионов, выделенных на различных этапах, а также культур, поступивших из ЛПУ и филиалов ФБУЗ:

·      изучение культуральных, морфологических свойств и подвижности микробных клеток;

·      определение типа расщепления глюкозы (тест Хью-Лейфсона);

·      определение ферментации углеводов и многоатомных спиртов (сахарозы, маннозы, арабинозы и маннита);

·      определение декарбоксилазной и дигидролазной активности по отношению к аминокислотам (аргинин, лизин, орнитин);

·      постановка развернутой реакции агглютинации с холерными агглютинирующими сыворотками O1, Инаба, Огава, RO и реакции слайд-агглютинации с холерной сывороткой O139 серогруппы;

·      оценка эпидемической значимости культуры комплексным методом - по гемолитической активности в пробе Грейга, чувствительности к холерным эльтор фагам ctx⁺ и ctx^- (кроме холерных вибрионов O139), в ПЦР на наличие генов ctxA и tcpA, в реакции объемной агломерации с полимерным антилипазным иммуноглобулиновым диагностикумом (РАО);

·      определение принадлежности к биовару холерных вибрионов O1 серогруппы (определение чувствительности к диагностическим бактериофагам классическому и эльтор, постановка реакции гемагглютинации с куриными эритроцитами, определение чувствительности к 50 ед./мл полимиксина В, постановка реакции Фогес-Проскауэра);

·      определение чувствительности к антибиотикам диско-диффузионным методом;

·      ИХ-тест на определение O1 серогруппы (при положительном результате - ИХ-тест на определение серовара Инаба, Огава) или O139 серогруппы.

5.3.2.4. Оформление результатов исследования

Регистрация результатов анализа в лаборатории ООИ ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» производится по учетным формам в соответствии с действующими методическими указаниями по лабораторной диагностике холеры.

5.3.2.5. Порядок взаимодействия лабораторий особо опасных инфекций ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации с учреждениями Роспотребнадзора

Информация о выделенных или идентифицированных культурах холерного вибриона передается в соответствии со схемой выдачи результатов исследований на холеру (прилож. 11) и направляется в Референс-центр по мониторингу за холерой.

Культуры холерного вибриона, выделенные от людей, из объектов окружающей среды и идентифицированные в лаборатории ООИ ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации направляют в Региональный центр по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности или Центр индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней (региональное противочумное учреждение). Срок доставки эпидемически значимых культур - не более 5 суток, остальные культуры доставляются не позднее одного месяца. Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с действующими санитарными правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности.

6. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий регионального уровня

6.1. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней II - IV групп патогенности в федеральных округах

Лаборатории Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней II - IV групп патогенности осуществляют:

·      диагностические исследования материала от больных и умерших с подозрением на холеру;

·      профилактические исследования материала от лиц, подлежащих обследованию на холеру в соответствии с требованиями эпидемиологического надзора (по согласованию);

·      исследования проб из объектов окружающей среды в соответствии с требованиями эпидемиологического надзора;

·      идентификацию культур холерных вибрионов по полной схеме;

·      контроль качества питательных сред.

Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней II - IV групп патогенности в федеральных округах соответствует п. 5.3.2. «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий особо опасных инфекций ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации.

Культуры холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп, выделенные от людей, из объектов окружающей среды и идентифицированные в лаборатории Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней II - IV групп патогенности передают в Региональный центр по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности или Центр индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней (региональное противочумное учреждение). Срок доставки эпидемически значимых культур - не более 5 суток, остальные культуры доставляются не позднее одного месяца. Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с действующими СП по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности.

6.2. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности и Центров индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней

6.2.1. Требования к лабораториям Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности и Центров индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней

Наличие разрешительных и регламентирующих работу документов

Учреждения, на базе которых функционируют Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней I - II групп патогенности и Центры индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней, должны иметь лицензию на деятельность, связанную с использованием возбудителей I - II групп патогенности (опасности).

Лаборатории Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности и Центров индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней должны иметь санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности) в соответствии с действующими санитарными правилами о порядке выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I - IV групп патогенности (опасности).

Лаборатории Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности и Центров индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней должны быть аккредитованы на техническую компетентность в установленном порядке в соответствии с действующей законодательной базой Российской Федерации.

Учет, хранение, передача и транспортирование выделенных культур холерных вибрионов должны осуществляться в соответствии с действующими санитарными правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности.

Утилизация отходов должна осуществляться в соответствии с действующими санитарными правилами по санитарно-эпидемиологическим требованиям к обращению с медицинскими отходами.

Проведение исследований на всех этапах: отбор проб, их хранение, доставка в лабораторию, регистрация, порядок исследования, выдача результатов, взаимодействие с учреждениями Роспотребнадзора должны соответствовать требованиям действующих нормативных и распорядительных документов.

Требования к специалистам и персоналу, участвующим в выполнении исследований на холеру

Исследования на холеру могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским, биологическим образованием, окончившие курсы первичной специализации по ООИ по специальности «Бактериология», имеющие допуск к работе с ПБА I - II групп на основании приказа руководителя учреждения.

Инженерно-технический персонал и дезинфекторы проходят специальную подготовку по месту работы в соответствии с должностными обязанностями.

Специалисты, осуществляющие деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных заболеваний, должны повышать квалификацию не реже одного раза в 5 лет и иметь сертификат специалиста.

Необходимый уровень подготовки специалистов с высшим медицинским (биологическим) образованием и средним медицинским образованием, повышение их квалификации по лабораторной диагностике холеры представлен в прилож. 1.

Требования к обеспечению безопасности работы персонала

Каждая лаборатория должна иметь пакет документов, определяющих режим безопасной работы сотрудников с учетом характера работ, особенностей технологии, свойств микроорганизмов. Документы должны быть согласованы с комиссией по контролю соблюдения требований биологической безопасности, специалистами по охране труда, противопожарным мероприятиям и утверждены руководителем учреждения. Результаты проверок знаний правил техники безопасности персонала при проведении работ фиксируются в специальном журнале.

Все сотрудники должны выполнять требования по обеспечению безопасности работы с материалом, подозрительным или зараженным возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности (опасности) в соответствии с действующими нормативными документами.

Порядок организации внутреннего контроля качества лабораторных исследований

Контроль качества диагностических исследований на холеру в лабораториях Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней I - II групп патогенности и Центров индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней включает:

·      контроль качества питательных сред, диагностических препаратов и тест-систем, эталонных штаммов, дисков с антибактериальными препаратами, дистиллированной воды, дезинфицирующих средств, химических реактивов;

·      контроль эффективности мембранных фильтров;

·      своевременную поверку средств измерений, аттестацию испытательного оборудования;

·      контроль качества стерильности фильтровальных установок, лабораторной посуды;

·      контроль качества стерилизации паровых и суховоздушных стерилизаторов;

·      контроль работы бактерицидных ламп;

·      контроль температурного режима работы холодильников и термостатов;

·      проверку состояния воздуха производственных помещений и боксов, температурного режима, влажности;

·      проверку санитарного состояния помещений, включая условия уборки, дезинфекции, контроля смывов с поверхностей и оборудования.

Результаты контроля фиксируют в специальных журналах.

Правила ведения документации

Ведение лабораторной документации, включая регистрационные и рабочие журналы, осуществляют в соответствии с требованиями действующих нормативно-методических документов.

Требования к материальным ресурсам, необходимым для выполнения диагностических исследований на холеру

Для проведения диагностических исследований на холеру в лабораториях должны быть в наличии:

·      питательные среды, зарегистрированные в установленном порядке (прилож. 3, 8);

·      диагностические препараты, тест-системы, антибактериальные препараты, зарегистрированные в установленном порядке (прилож. 4, 7, 8);

·      химические реактивы (прилож. 5);

·      приборы, оборудование, расходные материалы (прилож. 6).

6.2.2. Номенклатура и объем исследований

Лаборатории Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности и Центров индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней проводят:

·      исследования материала от больных и умерших с подозрением на холеру;

·      исследования проб из объектов окружающей среды;

·      идентификацию культур холерных вибрионов, выделенных в прикреплённых субъектах, по полной схеме с определением эпидемиологической значимости;

·      определение чувствительности холерных вибрионов к антибактериальным препаратам;

·      серологическое обследование больных холерой, вибриононосителей и других контингентов населения - по эпидпоказаниям;

·      проверку качества питательных сред и ингибиторов сопутствующей микрофлоры.

6.2.3. Порядок диагностических исследований на холеру в лабораториях Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности и Центров индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней

Порядок исследования клинического материала и проб из объектов окружающей среды соответствует п. 5.2.3.

Идентификация культур холерных вибрионов осуществляется по полной схеме, изложенной в действующих методических указаниях по лабораторной диагностике холеры.

В порядок бактериологического исследования на холеру дополнительно включены исследования сывороток крови больных (переболевших) холерой, вибриононосителей, а также других контингентов населения (по эпидпоказаниям) на наличие агглютининов и вибриоцидных антител.

При определении агглютининов в сыворотке крови ставят:

·      реакцию агглютинации с живыми культурами холерных вибрионов, выделенных от больных (вибриононосителей) в очаге в макро- или микрообъеме.

При определении вибриоцидных антител в сыворотке крови ставят:

·      реакцию вибриоцидных антител (РВА) на основе чашечного метода (Finkelstein);

·      РВА на основе ферментации углеводов.

6.2.4. Оформление результатов исследования

Регистрация результатов анализа в лаборатории Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности и Центров индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней производится по учетным формам в соответствии с действующими методическими указаниями по лабораторной диагностике холеры.

6.2.5. Порядок взаимодействия лабораторий Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности и Центров индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней с учреждениями Роспотребнадзора

Информация о выделенных и/или идентифицированных культурах холерного вибриона передается в соответствии с действующей нормативной документацией и направляется в Референс-центр по мониторингу за холерой и в Национальный Центр верификации диагностической деятельности Роспотребнадзора, осуществляющий функцию Государственной коллекции возбудителей особо опасных бактериальных инфекций I - II групп патогенности.

Штаммы холерных вибрионов, выделенные от людей, из объектов окружающей среды, идентифицированные в лабораториях Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности и в Центрах индикации и диагностики опасных инфекционных болезней, направляют в Референс-центр по мониторингу за холерой.

Срок доставки эпидемически значимых культур - не более 5 суток, остальные культуры доставляются не позднее одного месяца. Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с действующими санитарными правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности.

7. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий федерального уровня

7.1. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для Референс-центра по мониторингу за холерой

7.1.1. Требования к лабораториям Референс-центра по мониторингу за холерой

Наличие разрешительных и регламентирующих работу документов

Учреждение, на базе которого функционирует Референс-центр по мониторингу за холерой должно иметь лицензию на деятельность, связанную с использованием возбудителей I - II групп патогенности (опасности).

Лаборатории Референс-центра по мониторингу за холерой должны иметь санитарно-эпидемиологические заключения о возможности проведения работ с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности) в соответствии с действующими санитарными правилами о порядке выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I - IV групп патогенности (опасности).

Лаборатории Референс-центра по мониторингу за холерой должны быть аккредитованы на техническую компетентность в установленном порядке в соответствии с действующей законодательной базой Российской Федерации.

Учет, хранение, передача и транспортирование выделенных подозрительных культур холерных вибрионов должны осуществляться в соответствии с действующими санитарными правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности.

Утилизация отходов должна осуществляться в соответствии с действующими санитарными правилами по санитарно-эпидемиологическим требованиям к обращению с медицинскими отходами.

Проведение исследований на всех этапах: отбор проб, их хранение, доставка в лабораторию, регистрация, порядок исследования, выдача

результатов, взаимодействие с учреждениями Роспотребнадзора должны соответствовать требованиям действующих нормативных и распорядительных документов.

Требования к специалистам и персоналу, участвующим в выполнении исследований на холеру

Исследования на холеру могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским, биологическим образованием, окончившие курсы первичной специализации по ООИ по специальности «Бактериология», имеющие допуск к работе с ПБА I - II групп на основании приказа руководителя учреждения.

Инженерно-технический персонал, дезинфекторы и санитарки проходят специальную подготовку по месту работы в соответствии с должностными обязанностями.

Специалисты, осуществляющие деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных заболеваний, должны повышать квалификацию не реже одного раза в 5 лет и иметь сертификат специалиста.

Необходимый уровень подготовки специалистов с высшим медицинским (биологическим) образованием и средним медицинским образованием, повышение их квалификации по лабораторной диагностике холеры представлен в прилож. 1.

Требования к обеспечению безопасности работы персонала

Каждая лаборатория должна иметь пакет документов, определяющих режим безопасной работы сотрудников с учетом характера работ, особенностей технологии, свойств микроорганизмов. Документы должны быть согласованы с комиссией по контролю соблюдения требований биологической безопасности, специалистами по охране труда, противопожарным мероприятиям и утверждены руководителем учреждения. Результаты проверок знаний правил техники безопасности персонала при проведении работ фиксируются в специальном журнале.

Все сотрудники должны выполнять требования по обеспечению безопасности работы с материалом, подозрительным или зараженным возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности (опасности) в соответствии с действующими нормативными документами.

Порядок организации внутреннего контроля качества лабораторных исследований

Контроль качества диагностических исследований на холеру в лабораториях Референс-центра по мониторингу за холерой включает:

·      контроль качества питательных сред, диагностических препаратов и тест-систем, эталонных штаммов, дисков с антибактериальными препаратами, дистиллированной воды, дезинфицирующих средств, химических реактивов;

·      контроль эффективности мембранных фильтров;

·      своевременную поверку средств измерений, аттестацию испытательного оборудования;

·      контроль качества стерильности фильтровальных установок, лабораторной посуды;

·      контроль качества стерилизации паровых и суховоздушных стерилизаторов;

·      контроль температурного режима работы холодильников и термостатов;

·      контроль работы бактерицидных ламп;

·      проверку состояния воздуха производственных помещений и боксов, температурного режима, влажности;

·      проверку санитарного состояния помещений, включая условия уборки, дезинфекции, контроля смывов с поверхностей и оборудования.

Результаты контроля фиксируют в специальных журналах.

Правила ведения документации

Ведение лабораторной документации, включая регистрационные и рабочие журналы, осуществляют в соответствии с требованиями действующих нормативно-методических документов.

Требования к материальным ресурсам, необходимым для выполнения диагностических исследований на холеру

Для проведения диагностических исследований на холеру в лабораториях должны быть в наличии:

·      питательные среды, зарегистрированные в установленном порядке и экспериментальные серии (прилож. 3, 8);

·      диагностические препараты, тест-системы, антибактериальные препараты, зарегистрированные в установленном порядке и экспериментальные серии (прилож. 4, 7, 8);

·      химические реактивы (прилож. 5);

·      приборы, оборудование, расходные материалы (прилож. 6).

7.1.2. Номенклатура и объем исследований

Лаборатории Референс-центра по мониторингу за холерой:

·      проводят полную идентификацию и изучение биологических, молекулярно-биологических, биохимических свойств возбудителей холеры, в т.ч. культур с атипичными свойствами и вновь выявленных холерных вибрионов, явившихся причиной эпидемической вспышки;

·      определяют чувствительность холерных вибрионов к антибактериальным препаратам, изучают механизмы резистентности;

·      проводят серологическое обследование больных холерой, вибриононосителей и других контингентов населения - по эпидпоказаниям;

·      проводят исследование клинического материала и проб окружающей среды - по эпидпоказаниям.

7.1.3. Организация и обеспечение диагностической деятельности при мониторинге за холерой

Материалом для исследования служат культуры холерных вибрионов, в т.ч. культуры с атипичными свойствами, выделенные в лабораториях территориального и регионального уровней; вновь выявленные холерные вибрионы, явившиеся причиной вспышки; клинический материал, сыворотки крови больных холерой, вибриононосителей и других контингентов - по эпидпоказаниям.

При исследовании культур возбудителей холеры, в том числе культур с атипичными свойствами и вновь выявленных холерных вибрионов, явившихся причиной вспышки, используют биологические и современные высокотехнологичные методы бактериологического, иммуносерологического и молекулярно-генетического анализа, а также серологические методы при исследовании сывороток крови больных холерой, вибриононосителей и других контингентов населения, обследуемых по эпидемическим показаниям.

Порядок исследования клинического материала, проб из объектов окружающей среды на холеру соответствует п. 5.2.3.

Идентификация поступивших культур осуществляется по полной схеме:

·      изучение морфологии микробных клеток;

·      определение подвижности выделенной культуры в препарате висячей или раздавленной капли с последующим просмотром препаратов под микроскопом с фазово-контрастным устройством;

·      определение наличия индофенолоксидазы;

·      исследование методом флюоресцирующих антител;

·      определение типа расщепления глюкозы в среде Хью-Лейфсона;

·      определение способности ферментировать углеводы и многоатомные спирты;

·      определение декарбоксилазной и дигидролазной активности по отношению к отдельным аминокислотам (лизин, аргинин, орнитин);

·      постановка развернутой реакции агглютинации с холерными агглютинирующими сыворотками O1, Инаба, Огава, RO и реакции слайд-агглютинации с холерной сывороткой O139 серогруппы;

·      определение биовара холерных вибрионов O1 серогруппы (определение чувствительности к диагностическим бактериофагам классическому и эльтор, постановка гемагглютинации с куриными эритроцитами, определение чувствительности к 50 ед./мл полимиксина В, постановка реакции Фогес-Проскауэра);

·      определение эпидемической значимости культуры комплексным методом: по гемолитической активности в пробе Грейга, чувствительности к холерным эльтор ctx⁺ и ctx^- фагам (кроме холерных вибрионов O139 серогруппы), в ПЦР на наличие генов ctxА и tcpA, по определению холерогенности на модели кроликов-сосунков, по результатам реакции объёмной аггломерации с использованием полимерного иммуноглобулинового антилипазного диагностикума (РАО);

·      определение чувствительности к антибиотикам (диско-диффузионным методом, методом серийных разведений в агаре и бульоне);

·      постановка дополнительных тестов, определяющих принадлежность к роду Vibrio и виду Vibrio cholerae или другим видам патогенных вибрионов (определение протеолитических свойств; выявление Анастатической активности; определение образования индола; определение образования сероводорода; выявление способности к биолюминисценции; определение галофильности вибрионов; определение способности вибрионов к росту при различных температурах; определение образования нитратредуктазы; определение образования β-галактазидазы).

Расширенная характеристика культур с помощью молекулярно-биологических методов: по генам, ассоциированным с вирулентностью, проведение секвинирования, рестрикции, ген-амплификации, VNTR-типирование.

При идентификации культур холерных вибрионов с атипичными свойствами использование дополнительных серологических, иммунологических, биохимических и других методов для подтверждения принадлежности культур к роду Vibrio и виду Vibrio cholerae:

·      ПЦР с использованием дополнительных специфических праймеров;

·      реакции агглютинации с кроличьими холерными агглютинирующими сыворотками;

·      реакции слайд-агглютинации с использованием моноклональных антител;

·      реакции преципитации в геле;

·      адсорбции агглютининов по Кастеллани;

·      реакции агглютинации с убитыми кипячением культурами

Применение серологических методов исследования в соответствии с действующими нормативными документами. В сыворотках больных холерой, вибриононосителей и других контингентов населения, обследуемых по эпидпоказаниям, выявляют агглютинины, вибриоцидные антитела.

При определении агглютининов в сыворотке крови ставят:

·      реакцию агглютинации с живыми культурами холерных вибрионов, выделенных от больных (вибриононосителей) в очаге в макро- или микрообъеме.

При определении вибриоцидных антител в сыворотке крови ставят:

·      реакцию вибриоцидных антител (РВА) на основе чашечного метода (Finkelstein);

·      РВА на основе ферментации углеводов.

Возможно применение препаратов, предназначенных для серологической диагностики.

7.1.4. Порядок взаимодействия лабораторий Референс-центра по мониторингу за холерой с учреждениями Роспотребнадзора

Информация о выделенных и/или идентифицированных культурах холерного вибриона передается в соответствии с действующими нормативными документами и направляется в Центр верификации диагностической деятельности Роспотребнадзора, осуществляющий функцию Государственной коллекции возбудителей особо опасных бактериальных инфекций I - II групп патогенности.

Культуры холерного вибриона, идентифицированные в лабораториях Референс-центра по мониторингу за холерой, передают в Национальный Центр верификации диагностической деятельности Роспотребнадзора, осуществляющий функцию Государственной коллекции возбудителей особо опасных бактериальных инфекций I - II групп патогенности.

Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с действующими санитарными правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности.

7.2. Порядок и организация лабораторной диагностики холеры Национального Центра верификации диагностической деятельности

7.2.1. Требования к лабораториям Национального Центра верификации диагностической деятельности

Наличие разрешительных и регламентирующих работу документов, требования к специалистам и персоналу, участвующим в выполнении исследований на холеру, требования к обеспечению безопасности работы персонала, порядок организации внутреннего контроля лабораторных исследований, правила ведения документации и требования к материальным ресурсам, необходимым для выполнения диагностических исследований на холеру, аналогичны п. 7.1.1.

7.2.2. Номенклатура и объем исследований

Лаборатории Национального Центра верификации диагностической деятельности проводят:

·      верификацию результатов диагностики холеры и идентификации культур, полученных из Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности, Центров индикации и диагностики опасных инфекционных болезней Роспотребнадзора, Референс-центра по мониторингу за холерой;

·      выполняют диагностические исследования материала от больных холерой и умерших от этого заболевания - по эпидпоказаниям;

·      осуществляют хранение коллекционных штаммов, охраноспособное и авторское депонирование.

7.2.3. Организация и обеспечение диагностической деятельности

Порядок исследования клинического материала, проб из объектов окружающей среды на холеру соответствует п. 5.2.3.

Идентификацию культур осуществляют по полной схеме, дополнительно проводят:

·      секвенирование фрагментов генов 16S - 23S рДНК и других видоспецифичных локусов;

·      определение генотипов штаммов холерных вибрионов.

На основании результатов расширенной характеристики штаммов холерных вибрионов составляют паспорта на штаммы, хранящиеся в Национальном Центре верификации диагностической деятельности, осуществляющем функции Государственной коллекции.

7.2.4. Порядок взаимодействия лабораторий Национального Центра верификации диагностической деятельности с учреждениями Роспотребнадзора

Национальный Центр верификации диагностической деятельности Роспотребнадзора направляет результаты проведенных исследований в Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности, Центры индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней, Референс-центр по мониторингу за холерой.

Приложение 1

Подготовка кадров по лабораторной диагностике холеры в бактериологических лабораториях различных уровней

Приложение 2

Требования к профессиональным навыкам специалистов, осуществляющих лабораторную диагностику холеры

1. Требования к знаниям и умениям специалистов лечебно-профилактических учреждений, выполняющих бактериологические исследования на холеру

1.1. Врачи-бактериологи и биологи должны знать:

·      основные положения эпидемиологического надзора за холерой, в том числе в части, касающейся обследования больных на холеру;

·      нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на холеру;

·      требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на зараженность возбудителями III - IV групп патогенности, а также требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на зараженность возбудителем холеры;

·      этапы подготовительной работы (подготовка питательных сред, диагностических препаратов, реактивов);

·      требования к доставке клинического материала, регистрации, его хранению, уничтожению;

·      порядок исследования материала в условиях односменной и круглосуточной работы лаборатории;

·      порядок исследования материала в зависимости от времени отбора и доставки его в лабораторию;

·      этапы лабораторного исследования на холеру;

·      методы ускоренной диагностики холеры;

·      культуральные, морфологические, иммуносерологические и биохимические свойства холерных вибрионов;

·      сроки выдачи предварительного положительного результата исследования;

·      правила и сроки передачи выделенных (подозрительных) культур.

1.2. Врачи-бактериологи и биологи должны уметь выполнять диагностическое исследование клинического материала на холеру:

·      отбирать колонии со щелочного агара и среды TCBS с характерным для вибрионов ростом;

·      выполнять микроскопию мазков, окрашенных по Граму, на всех этапах исследования;

·      определять индофенолоксидазу;

·      ставить с подозрительными на холерный вибрион колониями реакцию слайд-агглютинации с холерными сыворотками O1, Огава, Инаба, RO и O139 и учитывать результаты;

·      выполнять микроскопию и оценку результатов мазков, обработанных флюоресцирующими иммуноглобулинами (МФА);

·      выполнять реакцию иммобилизации вибрионов (РИВ) под влиянием специфических холерных сывороток;

·      вести необходимую документацию.

1.3. Лаборанты, медицинские лабораторные техники и медицинские технологи должны знать:

·      правила работы с материалом, подозрительным на зараженность возбудителями III - IV групп патогенности;

·      этапы подготовительной работы (подготовку посуды, питательных сред, диагностических препаратов, реактивов;

·      этапы лабораторного исследования на холеру;

·      культуральные, морфологические свойства холерных вибрионов, отношение вибрионов к углеводам в полиуглеводных средах.

1.4. Лаборанты, медицинские лабораторные техники и медицинские технологи должны уметь:

·      готовить к работе необходимые питательные среды (прилож. 3);

·      готовить ингредиенты для окраски мазков по Граму;

·      готовить разведения сывороток для постановки реакции слайд-агглютинации и иммунофлюоресценции;

·      выполнять первичные посевы исследуемого материала и пересевы со сред обогащения;

·      готовить мазки, фиксировать их, окрашивать по Граму, а также флюоресцирующими иммуноглобулинами;

·      ставить пробу на индофенолоксидазу;

·      проводить с подозрительными на холерный вибрион колониями реакцию слайд-агглютинации с холерными сыворотками O1, Огава, Инаба, RO и O139;

·      ставить реакцию иммобилизации с холерными сыворотками;

·      готовить отработанный материал для автоклавирования.

2. Требования к знаниям и умениям специалистов ФБУЗ «ЦГиЭ» и их филиалов, выполняющих бактериологические исследования на холеру

2.1. Врачи-бактериологи и биологи должны знать:

·      основные положения эпидемиологического надзора за холерой, в т.ч. в части, касающейся сроков, объёмов и контингентов, подлежащих обследованию на холеру, сроков, объёмов и вида исследуемых проб из объектов окружающей среды;

·      нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на холеру;

·      требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на зараженность возбудителями III - IV групп патогенности, а также требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на зараженность возбудителем холеры;

·      этапы подготовительной работы (подготовка питательных сред, диагностических препаратов, реактивов);

·      требования к доставке клинического материала и проб из объектов внешней среды, регистрации, хранению, уничтожению;

·      порядок исследования материала в условиях односменной и круглосуточной работы лаборатории;

·      порядок исследования материала в зависимости от времени отбора и доставки его в лабораторию;

·      этапы лабораторного исследования на холеру;

·      методы ускоренной диагностики холеры;

·      культуральные, морфологические, иммуносерологические и биохимические свойства холерных вибрионов;

·      сроки выдачи предварительного положительного результата исследования;

·      правила и сроки передачи выделенных (подозрительных) культур.

2.2. Врачи-бактериологи и биологи должны уметь выполнять диагностическое исследование клинического материала на холеру:

·      отбирать колонии со щелочного агара и среды TCBS с характерным для вибрионов ростом;

·      выполнять микроскопию мазков, окрашенных по Граму, на всех этапах исследования;

·      определять индофенолоксидазу;

·      ставить с подозрительными на холерный вибрион колониями реакцию слайд-агглютинации с холерными сыворотками O1, Огава, Инаба, RО и O139;

·      выполнять микроскопию и оценку результатов мазков, обработанных флюоресцирующими иммуноглобулинами (МФА);

·      выполнять реакцию иммобилизации вибрионов (РИВ) под влиянием специфических холерных сывороток;

·      вести необходимую документацию.

2.3. Лаборанты, медицинские лабораторные техники и медицинские технологи должны знать:

·      правила работы с материалом, подозрительным на зараженность возбудителями III - IV групп патогенности;

·      этапы подготовительной работы (подготовку посуды, питательных сред, диагностических препаратов, реактивов;

·      этапы лабораторного исследования на холеру;

·      культуральные, морфологические свойства холерных вибрионов, отношение вибрионов к углеводам в полиуглеводных средах.

2.4. Лаборанты, медицинские лабораторные техники и медицинские технологи должны уметь:

·      осуществлять отбор проб воды из поверхностных водоёмов, сточных вод и других объектов окружающей среды;

·      готовить к работе необходимые питательные среды (прилож. 3);

·      готовить ингредиенты для окраски мазков по Граму;

·      готовить разведения сывороток для постановки реакции слайд-агглютинации и иммунофлюоресценции (при наличии люминесцентного микроскопа);

·      выполнять первичные посевы исследуемого материала и пересевы со сред обогащения;

·      готовить мазки, фиксировать их, окрашивать по Граму, а также флюоресцирующими иммуноглобулинами;

·      ставить пробу на индофенолоксидазу;

·      проводить с подозрительными на холерный вибрион колониями реакцию слайд-агглютинации с холерными сыворотками O1, Огава, Инаба, RO и O139;

·      ставить реакцию иммобилизации с холерными сыворотками;

·      готовить отработанный материал для автоклавирования.

3. Требования к знаниям и умениям специалистов лабораторий ООИ ФБУЗ «ЦГиЭ», выполняющих бактериологические исследования на холеру

3.1. Врачи-бактериологи и биологи должны знать:

·      основные положения эпидемиологического надзора за холерой, в том числе в части, касающейся обследования больных на холеру;

·      нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на холеру;

·      требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на зараженность возбудителями II - IV групп патогенности, а также требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на зараженность возбудителем холеры;

·      этапы подготовительной работы (подготовка питательных сред, диагностических препаратов, реактивов);

·      требования к доставке клинического материала, регистрации, его хранению, уничтожению;

·      порядок исследования материала в условиях односменной и круглосуточной работы лаборатории;

·      порядок исследования материала в зависимости от времени отбора и доставки его в лабораторию;

·      этапы лабораторного исследования на холеру;

·      методы ускоренной диагностики холеры;

·      культуральные, морфологические, иммуносерологические и биохимические свойства холерных вибрионов;

·      сроки выдачи предварительного положительного результата исследования;

·      правила и сроки передачи выделенных (подозрительных) культур;

·      методы контроля качества питательных сред и ингибиторов посторонней микрофлоры;

·      методы определения чувствительности к диагностическим фагам классическому и эльтор, холерным эльтор фагам ctx⁺ и ctx^-;

·      методы оценки эпидемической значимости холерных вибрионов;

·      методы определения антибиотикочувствительности холерных вибрионов.

3.2. Врачи-бактериологи и биологи должны уметь выполнять диагностическое исследование материала на холеру:

·      проводить исследование материала от больных и умерших с подозрением на холеру, от лиц, подлежащих бактериологическому обследованию на холеру, проб воды из стационарных и других точек отбора и других объектов окружающей среды, предусмотренных действующими санитарными правилами;

·      идентифицировать выделенные культуры холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп по сокращенной и полной схеме с определением эпидзначимости холерных вибрионов по наличию генов ctxА и tcpA, гемолитической активности и чувствительности к фагам ctx⁺ и ctx^-;

·      определять антибиотикочувствительность выделенных культур;

·      устанавливать таксономическую принадлежность холерных вибрионов не О1/не O139 серогрупп и других представителей рода Vibrio и семейства Vibrionaceae;

·      вести необходимую документацию.

3.3. Лаборанты, медицинские лабораторные техники и медицинские технологи должны знать:

·      правила работы с материалом, подозрительным на зараженность возбудителями III - IV групп патогенности;

·      этапы подготовительной работы (подготовку посуды, питательных сред, диагностических препаратов, реактивов;

·      этапы лабораторного исследования на холеру;

·      культуральные, морфологические и антигенные свойства холерных вибрионов, отношение вибрионов к углеводам в полиуглеводных средах;

·      методы полной и сокращенной идентификации холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп;

·      методы идентификации культур холерных вибрионов не O1/не O139 серогрупп и других представителей рода Vibrio и семейства Vibrionaceae;

·      методы определения качества питательных сред и ингибиторов роста посторонней микрофлоры.

3.4. Лаборанты, медицинские лабораторные техники и медицинские технологи должны уметь:

·      готовить к работе необходимые питательные среды (прилож. 3);

·      готовить ингредиенты для окраски мазков по Граму;

·      готовить разведения сывороток для постановки реакции слайд-агглютинации и иммунофлюоресценции (при наличии люминесцентного микроскопа);

·      выполнять первичные посевы исследуемого материала и пересевы со сред обогащения;

·      готовить мазки, фиксировать их, окрашивать по Граму, а также флюоресцирующими иммуноглобулинами;

·      ставить пробу на индофенолоксидазу;

·      проводить с подозрительными на холерный вибрион колониями реакцию слайд-агглютинации и объемную реакцию агглютинации с холерными сыворотками O1, Огава, Инаба, RO и O139;

·      ставить реакцию иммобилизации с холерными сыворотками;

·      готовить отработанный материал для автоклавирования.

4. Требования к знаниям и умениям специалистов Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности, Центров индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней, Референс-центра по мониторингу за холерой и Национального Центра верификации диагностической деятельности, выполняющих бактериологические исследования на холеру

4.1. Врачи-бактериологи и биологи должны знать:

·      основные положения эпидемиологического надзора за холерой;

·      вопросы организации лабораторных исследований на холеру;

·      требования биологической безопасности при работе с зараженным и подозрительным на заражение микроорганизмами II группы патогенности материалом;

·      таксономию и классификацию представителей семейства Vibrionaceae;

·      морфологические, культуральные, биохимические свойства холерных вибрионов;

·      серологические методы изучения свойств холерных вибрионов;

·      определение чувствительности к диагностическим фагам классическому и эльтор, холерным фагам эльтор ctx⁺ и ctx^-;

·      методы определения эпидемической значимости холерных вибрионов;

·      определение чувствительности к антибиотикам, химиопрепаратам и дезинфектантам;

·      этапы лабораторного исследования на холеру, сроки выдачи ответов, правила и сроки передачи выделенных культур;

·      требования к доставке материала, его хранению, регистрации, уничтожению, подготовке к передаче и транспортированию;

·      этапы подготовительной работы (подготовку питательных сред для выделения и идентификации холерных вибрионов, диагностических препаратов, реактивов);

·      методы серологической диагностики холеры у людей;

·      критерии оценки качества питательных сред, используемых для диагностики холеры, ингибиторов посторонней микрофлоры;

·      нормативные документы, используемые при проведении лабораторных исследований на холеру.

4.2. Врачи-бактериологи и биологи должны уметь:

·      провести полное исследование по схеме лабораторной диагностики холеры материала от больных и умерших с подозрением на холеру, проб из объектов окружающей среды;

·      идентифицировать выделенные культуры холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп по сокращенной и полной схеме;

·      определить эпидемическую значимость культур;

·      определить чувствительность к антибиотикам выделенных культур;

·      провести серологическую диагностику материала от больных холерой, вибриононосителей и других контингентов - по эпидпоказаниям;

·      установить таксономическую принадлежность холерных вибрионов не O1/не O139 серогрупп и других представителей рода Vibrio и семейства Vibrionaceae;

·      осуществлять контроль качества питательных сред и ингибиторов посторонней микрофлоры;

·      вести необходимую документацию.

4.3. Лаборанты, медицинские лабораторные техники и медицинские технологи должны знать:

·      морфологические, культуральные и основные биохимические свойства холерных вибрионов;

·      этапы лабораторного исследования на холеру;

·      методы полной и сокращенной идентификации холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп;

·      методы идентификации культур холерных вибрионов не O1/не O139 серогрупп и других представителей рода Vibrio и семейства Vibrionaceae;

·      методы серологической диагностики холеры;

·      правила работы с материалом, зараженным или подозрительным та заражение возбудителем холеры;

·      этапы подготовительной работы (подготовка посуды, красок, питательных сред для выделения и идентификации холерных вибрионов, диагностических препаратов, реактивов);

·      методы определения качества питательных сред и ингибиторов посторонней микрофлоры.

4.4. Лаборанты, медицинские лабораторные техники и медицинские технологи должны уметь:

·      приготовить или подготовить к работе питательные среды для выделения и идентификации холерных вибрионов (прилож. 3);

·      приготовить основные ингредиенты для окраски мазков по Граму;

·      приготовить реактивы для постановки пробы на оксидазу, выявления образования ацетилметилкарбинола, индола, сероводорода, нитратредуктазы, β-галактозидазы;

·      подготовить разведения сывороток для постановки слайд- и развернутой реакции агглютинации и иммунофлуоресценции;

·      произвести первичные посевы и пересевы поступившего материала;

·      сделать мазки, зафиксировать их и окрасить;

·      поставить пробу на индофенолоксидазу;

·      поставить слайд- и развернутую реакцию агглютинации с холерными сыворотками;

·      поставить реакцию иммобилизации с холерными сыворотками;

·      провести определение качества питательных сред и теллурита калия;

·      подготовить отработанный материал для автоклавирования;

·      участвовать:

 в идентификации выделенной культуры по полной и сокращенной схеме;

 в определении эпидемической значимости выделенной культуры по регламентированным для этих лабораторий тестам;

 в определении антибиотикочувствительности выделенных культур;

 в исследовании сывороток крови больных холерой и вибриононосителей в системе серологических реакций.

Приложение 3

Питательные среды, используемые при проведении лабораторной диагностики холеры

Приложение 4

Диагностические препараты, тест-системы, используемые при проведении лабораторной диагностики холеры

Приложение 5

Химические реактивы, используемые при проведении лабораторной диагностики холеры

Приложение 6

Приборы, оборудование, расходные материалы, используемые при проведении лабораторной диагностики холеры

Приложение 7

Антибактериальные препараты, используемые при проведении лабораторной диагностики холеры