4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
пестицидов в пищевых продуктах,
сельскохозяйственном сырье и объектах
окружающей среды

Сборник

МУК 4.1.2859 - 4.1.2866-11

Москва 2011

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России (В.А. Калинин, профессор, канд. с-х. наук., Е.В. Довгилевич, ст.н.сотр., канд. биол. наук, А. В. Довгилевич, ст.н.сотр., канд. хим. наук, Н.В. Устименко, ст.н.сотр., канд. биол. наук, Е.Н. Щербинкина, инженер).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 28 12.2010 № 3).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31 марта 2011 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств Пропизахлора
в воде, почве, зеленой массе, зерне кукурузы, семенах
подсолнечника, рапса и растительном масле методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания

Общие положения и область применения

Свидетельство об аттестации методики от 25.06.2010 № 01 5.04.685.

Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств Пропизахлора в воде в диапазоне концентраций 0,002 - 0,02 мг/кг, в почве, зеленой массе и зерне кукурузы, семенах подсолнечника и рапса в диапазоне концентраций 0,025 - 0,25 мг/кг, в растительном масле 0,05 - 0,5 мг/кг.

1. Краткая характеристика препарата

Действующее вещество: Пропизахлор.

Структурная формула:

Название действующего вещества по ИЮПАК: 2-хлор-6'-этил-N-изопропоксиметилацето-о-толуидин.

Эмпирическая формула: С₁₅Н₂₂СlNО₂.

Молекулярная масса: 283,8.

Химически чистое вещество: маслянистая жидкость от светло-коричневого до пурпурного цвета с характерным запахом.

Температура плавления: 21,6 °С.

Давление пара при 20 °С: 4 мПа.

K_owlogP = 3,50 (20 °С).

Растворимость в воде 184 мг/дм³. Растворим в большинстве органических растворителей. Гидролитически стабилен. Через 5 дней хранения при 50 °С (рН 4, 7, 9) степень разложения составляет менее 10 %.

Краткая токсикологическая характеристика: острая оральная токсичность LD₅₀ для крыс 3433 мг/кг (мужские особи) и 2088 мг/кг (женские особи). Дермальная токсичность LD₅₀ превышает 2000 мг/кг, а ингаляционная LC₅₀ - 5000 мг/м³ для животных обоих полов (крысы).

Область применения: Пропизахлор - селективный гербицид для регулирования роста однолетних трав и некоторых широколистных сорняков на почвах кукурузы, подсолнечника, сои, картофеля и гороха.

Механизм действия заключается в ингибировании деления клеток посредством блокирования белкового синтеза при адсорбции гербицида на корнях прорастающих растений.

Гигиенические нормативы для Пропизахлора в России не установлены.

2. Методика определения Пропизахлора в воде, почве, зеленой массе, зерне кукурузы, семенах подсолнечника, рапса и растительном масле методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

2.1.1. Область применения и принцип метода

Настоящие методические указания устанавливают метод определения остаточных количеств Пропизахлора в воде водоемов в диапазоне концентраций 0,002 - 0,01 мг/кг, в почве, зеленой массе, зерне кукурузы, семенах подсолнечника и рапса в диапазоне концентраций 0,025 - 0,25 мг/кг и в растительном масле - 0,05 - 0,5 мг/кг.

Методика основана на определении Пропизахлора методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов водным ацетоном или ацетонитрилом с последующей очисткой на концентрирующих патронах.

2.1.2. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Полнота извлечения Пропизахлора, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, Р = 0.95

2.1.3. Избирательность метода

Избирательность метода определения Пропизахлора достигается сочетанием условий подготовки проб и хроматографического анализа.

2.2. Реактивы и материалы

Допускается использование реактивов и материалов с характеристиками не хуже указанных.

2.3. Приборы и посуда

Допускается использование средств измерения и вспомогательного оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

2.4. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 29168-89 «Почвы. Отбор проб», ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб». Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями 1 мм.

Зеленую массу замораживают при температуре - 18 °С и хранят в морозильной камере в полиэтиленовой упаковке в течение года.

Отбор проб семян подсолнечника и рапса производится в соответствии с ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб». Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Растительное масло хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители при необходимости перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2 %-м раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 дм³ ацетона 10 г КМnО₄ и 2 г К₂СО₃). Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием. Диэтиловый эфир перед употреблением высушивают над едким кали.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитические колонки кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 мл/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1 ч.

2.5.3. Приготовление растворов

Для приготовления 0,005 М раствора ортофосфорной кислоты 0,5 г 98 % ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

2.5.3.1. Приготовление стандартного и градуировочных растворов.

Точную навеску Пропизахлора (50 мг) помещают в мерную колбу объемом 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/см³). Градуировочные растворы с концентрациями 2,5, 5,0, 10,0, 20,0 и 25,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя подвижную фазу.

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике в силанизированном или тефлоновом флаконе при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы используют в течение рабочего дня.

При изучении полноты извлечения Пропизахлора используют ацетонитрильные растворы вещества.

2.5.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация Пропизахлора в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации Пропизахлора в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

С = KS, где

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

С - аттестованное значение массовой концентрации Пропизахлора в градуировочном растворе;

С_к - результат контрольного измерения массовой концентрации Пропизахлора в градуировочном раствор;

λ_контр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, % λ_контр. = 10 % при Р = 0,95).

2.5.5. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

2.5.6. Подготовка концентрирующих патронов для очистки экстракта

2.5.6.1. Кондиционирование патронов, заполненных гексадецилсиликагелем, - Диапак С16 (0,4 г), осуществляют, пропуская через патрон последовательно по 1 см³ ацетонитрила и воды. Элюат отбрасывают.

2.5.6.2. Кондиционирование патронов, заполненных силикагелем 60 (0,5 г), осуществляют пропусканием 2,5 см³ гексана.

2.6. Проведение определения

2.6.1. Определение Пропизахлора в пробах воды

Аликвоту предварительно отфильтрованной воды (50 см³) пропускают через откондиционированный патрон Диапак С16 (0,4 г). Фильтрат отбрасывают. Пропизахлор элюируют 5 см³ ацетонитрила. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 0,4 см³ подвижной фазы. 10 мм³ вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.2. Определение Пропизахлора в пробах почвы

Образец просеянной через сито почвы массой 10 г помещают в коническую колбу вместимостью 100 см³ с притертой пробкой, прибавляют 5 см³ воды и 35 см³ ацетона и экстрагируют в УЗ-бане в течение 15 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера (фильтр «красная лента»), осадок на фильтре промывают 5 см³ ацетона. Экстракцию повторяют и объединенные фильтраты упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Водный остаток пропускают через два соединенных последовательно и откондиционированных патрона Диапак С16, промывают двумя порциями воды по 2 см³. Фильтрат и промывки отбрасывают. Пропизахлор элюируют 4 см³ ацетонитрила. Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и 10 мм³ полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.3. Определение Пропизахлора в зерне кукурузы, семенах подсолнечника и рапса, зеленой массе рапса и кукурузы

Навеску размолотых на лабораторной мельнице семян или измельченной зеленой массы (20 г) помещают в коническую колбу вместимостью 250 см³, прибавляют 50 см³ 80 % водного ацетона* и экстрагируют в УЗ-бане в течение 15 мин при температуре 30 °С. Экстракцию повторяют еще два раза. Экстракт упаривают на ротационном испарителе до полного удаления ацетона при температуре водяной бани 40 °С. Водный остаток фильтруют через бумажный фильтр и пропускают через два соединенных последовательно и откондиционированных патрона Диапак С16. Фильтрат и промывки отбрасывают. Пропизахлор элюируют 4 см³ ацетонитрила. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ гексана и количественно вносят в откондиционированный патрон с силикагелем 60. Патрон промывают дважды 2,5 см³ гексана. Фильтрат и промывки отбрасывают. Пропизахлор элюируют 3 см³ смеси гексан-эфир в соотношении 7:3. Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 см³ подвижной фазы и 10 мм³ образца вводят в жидкостный хроматограф.

_____________

* При определении Пропизахлора в зеленой массе прибавляют 50 см³ ацетона, не содержащего воды.

2.6.4. Определение Пропизахлора в растительном масле

К 5 г масла прибавляют 40 см³ ацетонитрила и экстрагируют в УЗ-бане в течение 15 мин при 30 °С. Экстракцию повторяют с двумя свежими порциями ацетонитрила по 40 см³. Объединенный экстракт центрифугируют в течение 10 мин при скорости 8000 об/мин. Супернатант промывают тремя порциями гексана по 20 см³. Гексановые промывки отбрасывают. Ацетонитрильный раствор упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ гексана и далее пробу чистят на патроне с силикагелем 60 так, как это описано в п. 2.6.1. После очистки сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и 10 мм³ образца вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.5. Условия хроматографировант

Ультраэффективный жидкостной хроматограф «ACQUITY» фирмы «Waters» с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Для анализа проб масла, зеленой массы и семян подсолнечника используют колонку 1. Пробы рапса и зерна кукурузы анализируют на колонке 2. Температура колонки (30 ± 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 53:47 (колонка 1) и 60:40 (колонка 2). Скорость потока элюента 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 220 нм. Объем вводимой пробы 10 мм³. Время удерживания Пропизахлора на колонках 1 и 2 составляет 5,1 ± 0,2 мин.

3. Обработка результатов анализа

Содержание Пропизахлора в воде, почве, зерне кукурузы, семенах подсолнечника и рапса, зеленой массе, растительном масле (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S₁ - площадь пика Пропизахлора в стандартном растворе (мВ сек);

S₂ - площадь пика Пропизахлора в анализируемой пробе (мВ сек);

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г;

С - концентрация стандартного раствора Пропизахлора, мкг/см³.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор Пропизахлора 1 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

4. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает придела повторяемости (1):

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (r = 2,8 σ_r).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

5. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

( ± Δ) мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

Δ = δ∙X/100, где

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее нижней границы определения» (например: менее 0,025 мг/кг*, где * - 0,025 мг/кг - предел обнаружения Пропизахлора в почве).

6. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

6.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

6.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

C_д = Δ_л,Х + Δ_л,Х', где

±Δ_л,Х (±Δ_л,Х') - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:

Δ_л = ± 0,84Δ, где

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

Δ = δ∙Х/100, где

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

К_к = Х' - Х - C_д, где

X', X, C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

6.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

7. Требования безопасности

7.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

7.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны».

8. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 6.

9. Разработчики

Долженко В.И., Цибульская И.А., Журкович И.К., Луговкина Н.В., Ковров Н.Г.

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, г. Санкт-Петербург.

Методика прошла метрологическую экспертизу (Свидетельство об аттестации № 01.5.04.693 от 23.11.2010).