4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения
концентрации клеток дрожжевого гриба
Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 -
продуцента липазы в атмосферном
воздухе населенных мест и
воздухе рабочей зоны

Методические указания
МУК 4.2.2715-10

МУК 4.2.2725-10

Москва • 2011

1. Разработаны ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет (д.б.н. Н.И. Шеина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 № 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 4 августа 2010 г.

4. Введены в действие с 4 октября 2010 г.

5. Введены впервые.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения
концентрации клеток В. amyloliquefaciens
ВКПМ В-10291 - продуцента a-амилазы
в атмосферном воздухе населенных мест

Методические указания

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 - продуцента липазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 5 до 50 000 клеток в 1 м³ воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения учреждениями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также лабораториями организаций, аккредитованными в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

2. Биологическая характеристика дрожжевого гриба Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 и его гигиенический норматив

Штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 является продуцентом липазы. Штамм создан с помощью генетических методов в ГосНИИ генетика и депонирован в ВКПМ.

Для дрожжей данного вида липолитическая активность является таксономическим признаком. Оптимум температуры для продукции липазы дрожжами составляет 29 °C, pH среды 5,5. При температуре 42 °C не растет.

Способен расти в присутствии циклогексимида, обладает уреазной активностью, нитрат не использует, сахара не сбраживает. В роде один вид, известный своей способностью к интенсивному образованию липолитических и протеолитических ферментов. Телеоморфа - Candida paralipolytica. Встречается у человека и других млекопитающих, в зерне, маслинах и нефтепродуктах.

Систематическое положение микроорганизма

Класс	Fungi imperfecti
Порядок	Blastomycetales
Род	Yarrowia
Вид	lipolytica
Штамм	ВКПМ Y-3323

На LB-агаре на 2-е и 3-и сутки вырастают колонии белого цвета, сухие, круглые, поднимающиеся над агаром. Края колонии ровные, у старой культуры возможно образование складок и концентрических кругов различной плотности. Максимальный диаметр - 10 - 12 мм.

Клетки круглые, эллипсоидные или удлиненные. Бесполое размножение - многосторонним почкованием на узком основании. Образуется псевдомицелий или истинный мицелий, который может иногда распадаться на артроспоры. Аски не конъюгативные, образуются из диплоидных клеток гиф. Оболочка аска быстро растворяется. В аске 1 - 4 аскоспоры, шаровидные, полусферические или шляповидные.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 500 кл./м³, пометка А.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток плесневого гриба в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 5 до 50000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток дрожжевого гриба на поверхность агаризованной среды и подсчете выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам на 3-и сутки.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

5.2. Реактивы, растворы

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. Санитарные правила СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами».

6.2. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.3. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.4. Руководство «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980), «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5) °C, атмосферном давлении 740 - 760 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 70 %.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток микроорганизма воздух аспирируют при помощи пробоотборника со скоростью 100 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 - 5 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных колоний, выросших на 2 - 3-и сутки после посева проб воздуха по культурально-морфологическим признакам. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

LD-агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °C, добавляют циклогекксемид, из расчета 0,5 г на 1 л среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры и микромицетов), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °C, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при температуре 29 - 30 °C. Через 2 - 3 суток производят подсчет выросших типичных по морфологическим признакам колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

Дополнительным функциональным методом является отбор пробы воздуха на чашки Петри с желточным агаром.

Для приготовления желточного агара смешивают указанные выше компоненты, смесь кипятят до растворения агара, стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм. и охлаждают до 60 °C. Скорлупу яйца дезинфицируют спиртом. Яйцо разбивают, отделяют желток от белка и переносят с соблюдением правил асептики в расплавленный агар. Агар перемешивают до получения однородной суспензии, разливают по чашкам и оставляют по полного затвердевания.

После отбора проб воздуха чашки инкубируют в термостате при 29 °C в течение 48 - 72 ч и внимательно просматривают в косом освещении. Вокруг колоний штамма, продуцирующего липазу, образуются маслянистые, блестящие с переливами или перламутровые зоны.

Ростовые свойства всех используемых питательных сред должны быть проверены в соответствии с «Требованиями к ростовым свойствам питательных сред» (Государственная Фармакопея СССР, изд. XI, вып. 2, с. 208), что позволит более полно оценить пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается на 2 - 3 чашки каждой используемой среды.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м³ воздуха производят по формуле:

 где

X - концентрация клеток продуцента в воздухе;

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме:

Протокол №
количественного микробиологического анализа штамма-продуцента
Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 в воздухе рабочей зоны

1. Наименование и адрес испытательной лаборатории (центра), проводящей измерения, аттестат аккредитации лаборатории.

2. Юридический и фактический адрес организации-заказчика.

3. Идентификация используемого метода, методики, ссылки на методы, используемые испытательной лабораторией.

4. Описание состояния объекта исследования.

5. Дата получения объекта измерений и дата проведения анализа.

6. Место отбора пробы.

Результаты микробиологического анализа

Ответственный исполнитель:

Руководитель:

Список литературы

1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования».

2. ГОСТ Р 8.563-96 ГСИ «Методики выполнения измерений».

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.

СОДЕРЖАНИЕ