Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение
концентрации клеток и спор
микроорганизмов в воздухе
рабочей зоны и атмосферном воздухе

Сборник методических указаний

МУК 4.2.2233 - 4.2.2239-07

Москва • 2010

1. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 29 марта 2007 г. № 1).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 августа 2007 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение
концентрации клеток плесневого гриба
Penicillium canescens PlPh33 - продуцента
пектинлиазы и фитазы в атмосферном
воздухе населенных мест

Методические указания
МУК 4.2.2235-07

1. Разработаны ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет» (к.б.н. Н.И. Шеина).

2. Введены в действие с 1 октября 2007 г.

3. Введены впервые.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма P. canescens PlPh33 - продуцента пектинлиазы и фитазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м³ воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в учреждениях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

Биологическая характеристика
P. canescens PlPh33 и его гигиенический норматив

Штамм мицелиального гриба Penicillium canescens PlPh33 является продуцентом пектинлиазы и фитазы. Получен из штамма Penicillium canescens ВКПМ F-178 путем селекции. Депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ F-3867D.

Растет на агаризованных средах (среда Чапека с дрожжевым автолизатом, сусло-агар, Мальц-агар, глюкозо-картофельный агар) при температуре 2528 °С в течение 57 сут., pH 5,0 - 6,0. При температуре 5 и 37 °С роста колоний не наблюдается.

На среде Чапека с дрожжевым автолизатом и сусло-агаре колонии достигают максимального диаметра 56 см. Колонии радиально складчатые, средней плотности, ростовая зона плотная. Мицелий белый, конидиальная зона голубовато-серебристая, конидиогенез обильный. Обратная сторона палевая, буроватая, со временем темно-коричневая.

При микроскопическом исследовании конидиеносцы двухъярусные, терминальные, фуркатные, шероховатые, длиной 150 мкм, шириной 34мкм. Метулы шероховатые, размером 10 - 18×2,5 - 3,5 мкм, фиалиды ампулиформные, размером 7 - 8×2 - 3 мкм, конидии чаще округлые, гладкие, размером 2,2 - 3,0×2,0 - 3,0 мкм.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 200 кл./м³, пометка А.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 10 до 5 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность агаризованной среды и подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам на 3-и сут.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Импактор микробиологический «Флора-100»	ТУ 9443-001-05031637-2002
Прибор MAS-100 ECO фирмы Merk (Германия) для отбора проб воздуха
Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова)	ТУ 64-12791-77
Термостаты электрические суховоздушные или водяные
Автоклав электрический	ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Ареометр-сахарометр с диапазоном измерений 0,10 % с ценой деления 0,1 %	ГОСТ 18481-87
Весы лабораторные аналитические, типа BЛA-200
Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211
Лупа с увеличением×10	ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные, диаметром 90 мм	ГОСТ 23932-90
Пробирки бактериологические П1 и П2, вместимостью 15 и 20 мл	ГОСТ 25336-82
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл	ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл	ГОСТ 1770-74
Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл	ГОСТ 1770-74
Секундомер	ГОСТ 9586-75
Барометр	ГОСТ 24696-79
Марля медицинская	ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая	ГОСТ 25556-81

5.2. Реактивы, растворы

Агар микробиологический	ГОСТ 17206-84
Экстракт солодовый	ГОСТ 418-84
Пектин	ГОСТ Р 51806-2001
Вода дистиллированная	ГОСТ 6709-72
Спирт этиловый ректификат	ГОСТ 5962-67
Кислота молочная пищевая (для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной флоры)	ГОСТ 490-79

Среда сусло-агар: солодовое сусло 7 °Б - 98 %, агар-агар - 2 %, pH среды 4,55,0, режим стерилизации: Р - 0,8 кгс/см , 40 мин. Для приготовления солодового сусла 7 °Б солодовый экстракт растворяют в дистиллированной воде до 7 %-го содержания сахара с помощью ареометра.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают требования:

• санитарных правил СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами»;

• правил техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;

• правил электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора;

• «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5) °С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток плесневого гриба воздух аспирируют при помощи пробоотборника со скоростью 10 л/мин на поверхность агаризованной среды. Время аспирации воздуха (5 - 20 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных колоний, выросших на 3-и сут. после посева проб воздуха по культурально-морфологическим признакам. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Агаризованную среду сусло-агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °С, добавляют молочную кислоту из расчета 2 мл на 0,5 л среды (для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной микрофлоры, pH 5,0 - 6,0), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при температуре 28 °С. Через 3 - 4 сут. проводят подсчет выросших типичных по морфологическим признакам колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

При микробиологическом анализе воздуха производственных помещений дополнительным функциональным методом является отбор пробы воздуха на чашки Петри с агаризованной средой. После отбора проб чашки покрывают слоем 2 %-го водного пектина толщиной 0,5 см. Затем инкубируют в термостате при 28 °С в течение 48 - 72 ч и подсчитывают количество зон осветления и разложения пектина вокруг выросших колоний.

Ростовые свойства всех используемых питательных сред должны быть проверены в соответствии с «Требованиями к ростовым свойствам питательных сред» (Государственная Фармакопея СССР, изд. XI, вып. 2. С. 208), что позволит более полно оценить пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается на 2 - 3 чашки каждой используемой среды.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м³ воздуха проводят по формуле:

, где

X- концентрация клеток продуцента в воздухе, кл./м³;

N количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

V объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по приведенной форме.

Список литературы

1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД 52.04.186-96. М., 1991.693 с.

2. ГОСТ 8.563-96 ГСИ «Методики выполнения измерений».

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980.27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977.7 с.

5. ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ». М.: Изд-во стандартов, 1981.

6. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: МГУ. С. 122.

СОДЕРЖАНИЕ