Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Спектрофотометрическое определение
субтилизина (протеазы) в атмосферном воздухе

 

Методические указания
МУК 4.1.1959-03

 

Спектрофотометрическое определение субтилизина (протеазы) в атмосферном воздухе: Методические указания.- М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2006.

1. Разработаны ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н Сысина РАМН (к. х. н. А.А. Беззубовым) и НИЦ «ЭКОС» (В.А. Смирновым).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 21 апреля 2005 г.

3. Введены в действие с 1 июля 2005 г.

4. Введены впервые

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Спектрофотометрическое определение субтилизина
(протеазы) в атмосферном воздухе

1. Область применения

Настоящие методические указания устанавливают количественный спектрофотометрический анализ атмосферного воздуха для определения в нем субтилизина (протеазы) в диапазоне концентраций 0,005 - 0,05 мг/м³.

Методические указания предназначены для использования лабораториями центров гигиены и эпидемиологии при осуществлении аналитического контроля химического загрязнения атмосферного воздуха в районе расположения производства субтилизина (протеазы), производственными лабораториями предприятий, научно-исследовательскими институтами, работающими в области гигиены окружающей среды.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 «Методика выполнения измерений», ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ».

Методические указания одобрены и рекомендованы к практическому применению на бюро секции по физико-химическим методам исследования объектов окружающей среды Проблемной комиссии «Научные основы экологии человека и гигиены окружающей среды» и бюро Комиссии по государственному санитарно-эпидемиологическом нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Физико-химические и токсикологические свойства

Субтилизин (протеаза) является ферментом класса гидролаз и катализирует гидролиз белков и пептидов, а также сложных эфиров и амидов N-защищенных аминокислот. Продуцируется Bacillus subtilis и родственными бактериями. Молекулярная масса более 27000. Выпускается в виде гранул кремового цвета со слабым запахом. Растворим в воде и растворах щелочей. Применяется в химической промышленности, в частности, как добавка к синтетическим моющим средствам.

Субтилизин (протеаза) обладает раздражающим действием на кожу и слизистые оболочки глаз, является аллергеном. В атмосферном воздухе находится в виде аэрозоля. ОБУВ протеазы щелочной - 0,01 мг/м³.

3. Погрешность измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений с погрешностью, не превышающей ± 21 %. При доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Измерение концентраций субтилизина (протеазы) основано на улавливании его из воздуха и концентрировании на фильтре с последующей десорбцией 2Н раствором гидрооксида натрия, реакции образования окрашенного комплекса с солью меди (метод Лоури) и последующем спектрофотометрировании при длине волны 650 нм.

Нижний предел измерения содержания субтилизина (протеазы) в анализируемом объеме пробы - 10 мкг.

Измерению мешают фенол, тимол, сульфосалицил, а также белки.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.

5.1. Средства измерений

Спектрофотометр СФ-46 или

аналогичный прибор

Весы аналитические ВЛА-200                                                 ГОСТ 24104-01

Меры массы                                                                               ГОСТ 7328-01

Колбы мерные, вместимостью 25, 100 и 1000 см³                 ГОСТ 1770-74Е

Пипетки, вместимостью 1, 2, 5 и 10 см³                                 ГОСТ 29196-91

Бюксы, вместимостью 25 см³                                                  ГОСТ 25336-83Е

Пробирки колориметрические с притертыми

пробками, вместимостью 20 см³                                             ГОСТ 25336-82Е

Барометр-анероид М-67                                                           ТУ 2504-1797-75

Термометр лабораторный шкальный ТЛ-2                            ГОСТ 215-73Е

Секундомер                                                                                ГОСТ 5072-79

Электроаспиратор марки 822                                                  ГОСТ 2.6.01-86

5.2. Вспомогательные устройства

Фильтродержатель с металлической сеткой                         ТУ 6-09-1706-77

Баня водяная                                                                              ТУ 64-1-2850-76

Дистиллятор                                                                              ТУ 61-1-721 -79

5.3. Материалы

Фильтр АФА-ХА-20                                                                 ТУ 95-743-80

5.4. Реактивы

Протеаза с содержанием основного вещества

не менее 95 %                                                                            СП 23701-81

Гидрооксид натрия, х.ч.                                                           ГОСТ 4328-77

Кислота соляная, х.ч.                                                                ГОСТ 4461-77

Натрий углекислый, х.ч.                                                           ГОСТ 84-76

Калий-натрий тартрат, х.ч.                                                      ГОСТ 5845-70

Медь серно-кислая, х.ч.                                                            ГОСТ 4165-78

Натрий вольфрамово-кислый, х.ч.                                          ГОСТ 18289-76

Натрий молибденово-кислый, х.ч.                                          ГОСТ 10931-74

Литий серно-кислый, х.ч.                                                         ГОСТ 10563-76

Кислота ортофосфорная, х.ч.                                                   ГОСТ 10678-76

Бром

Фенолфталеин

6. Требования безопасности

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. При выполнении измерений концентраций субтилизина (протеазы) с использованием спектрофотометра СФ-46 и электроаспиратора следует соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

7. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке их результатов на спектрофотометре и электроаспираторе допускаются лица, знающие устройство и правила эксплуатации приборов.

8. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

8.1. Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5) °С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.

8.2. Выполнение измерений на спектрофотометре СФ-46 проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору и настоящими методическими указаниями.

9. Подготовка к выполнению измерений и проведение измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: приготовление реактивов, подготовка спектрофотометра к работе, установление градуировочной характеристики, отбор проб

9.1. Приготовление растворов

Исходный раствор протеазы для градуировки (с = 1 мг/см³). В мерную колбу емкостью 25 см³ вносят 26,3 мг (95 % основного вещества), доводят 2Н раствором гидроокиси натрия до метки и тщательно перемешивают. Срок хранения исходного раствора 6 часов.

Рабочий раствор протеазы для градуировки (с = 100 мкг/см³). В мерную колбу емкостью 25 см³ помещают 2,5 см³ исходного раствора, доводят 2Н раствором гидрооксида натрия до метки и тщательно перемешивают. Срок хранения рабочего раствора 6 часов.

0,1 Н раствор гидрооксида натрия. В колбу емкостью 1000 см³ помещают 4,0 г гидрооксида натрия, приливают дистиллированную воду до метки и тщательно перемешивают до полного растворения.

2 Н раствор гидрооксида натрия. В колбу емкостью 1000 см³ помещают 80,0 г гидроокиси натрия, приливают дистиллированную воду до метки и тщательно перемешивают до полного растворения.

Рабочий раствор № 1. В колбу емкостью 100 см³ помещают 10,0 г углекислого натрия, 0,2 г калий-натрий тартрата, 0,05 г серно-кислой меди, приливают дистиллированную воду до метки и тщательно перемешивают.

Исходный раствор реактива Фолина. В кругло донную колбу емкостью 1000 см³ помещают 50,0 г натрия вольфрамово-кислого, 12,5 г натрия молибденово-кислого, добавляют 360 см³ дистиллированной воды и перемешивают до полного растворения реактивов. К полученному раствору добавляют 25 см³ 85 % раствора ортофосфорной кислоты, 50 см³ концентрированной соляной кислоты и смесь кипятят в течение 10 ч с обратным холодильником. Затем добавляют 76 г лития сернокислого, 25 см³ дистиллированной воды и 3 капли брома. Кипятят под тягой без обратного холодильника для удаления остатка брома. Охлаждают до комнатной температуры и доводят дистиллированной водой до объема 500 см³, перемешивают и фильтруют. Из фильтрата отбирают 1 см³, добавляют 9 см³ дистиллированной воды и титруют 0,1 н раствором гидрооксида натрия по фенолфталеину. Реактив Фолина с установленным титром доводят дистиллированной водой до 1 н концентрации. Раствор хранят в темной склянке с притертой пробкой в холодильнике Срок хранения реактива - 1 месяц.

Рабочий раствор реактива Фолина готовят перед употреблением путем разбавления 1 см³ исходного раствора реактива Фолина дистиллированной водой до объема 8 см³ в расчете на одну пробу.

9.2. Подготовка спектрофотометра к работе

Подготовку спектрофотометра к работе проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

9.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику устанавливают на градуировочных растворах. Она выражает зависимость оптической плотности растворов от массы субтилизина (протеазы) и устанавливается по 5 сериям растворов для градуировки.

Каждую серию, состоящую из 6 растворов, готовят в пробирках с притертыми пробками. Для этого в них вносят рабочий раствор протеазы и 2 Н раствор гидрооксида натрия в соответствии с таблицей. После этого в каждую пробирку приливают 2,0 см³ рабочего раствора № 1, тщательно перемешивают и выдерживают в течение 10 мин. Затем добавляют 8 см³ рабочего раствора реактива Фолина, перемешивают и нагревают на водяной бане при температуре 50 °С в течение 5 мин. После быстрого охлаждения замеряют оптическую плотность растворов в кювете с толщиной оптического слоя 2,0 мм при длине волны 650 нм по отношению к раствору № 1 в таблице. Строят градуировочную характеристику, нанося на ось ординат значения оптических плотностей градуировочных растворов, а на ось абсцисс - соответствующие им величины содержания протеазы. Градуировку проверяют 1 раз в 3 месяца или в случае использования новой партии реактивов.

Таблица

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении концентрации субтилизина (протеазы)

9.4. Отбор проб

Отбор проб воздуха, содержащего субтилизин (протеазу), проводят согласно ГОСТ 17.2.3.01-86. Воздух аспирируют с помощью электроаспиратора через фильтр со скоростью 200 дм³/мин в течение 30 мин. Отобранные пробы помещают в пробирки с притертыми пробками Срок хранения - 3 дня.

10. Выполнение измерений

Фильтр с отобранной пробой помещают в бюкс, заливают 3 см³ 2 Н раствора гидрооксида натрия и оставляют на 10 - 15 мин, периодически помешивая стеклянной палочкой. Степень десорбции протеазы с фильтра 98 %. Фильтр отжимают и отбрасывают. Для анализа отбирают 1,0 см полученного раствора и далее проводят анализ в условиях, описанных в п. 9.3.

Расчет содержания субтилизина (протеазы) проводят по градуировочной характеристике.

11. Вычисление результатов измерений

Концентрацию субтилизина (протеазы) в атмосферном воздухе (мг/м³) вычисляют по формуле

 где

т - содержание субтилизина (протеазы) в анализируемом объеме пробы, мкг;

V₁ - общий объем пробы, см³;

V₁ - объем пробы, взятой для анализа, см³;

V₀ - объем воздуха, взятого для анализа и приведенного к нормальным условиям, дм³;

 где

V - объем воздуха, взятого для анализа, дм;

Р - атмосферное давление, мм рт. ст.;

Т - температура воздуха в месте отбора пробы, °С.

12. Оформление результатов измерений

Результаты измерений концентраций субтилизина (протеазы) оформляют протоколом в виде: С, мг/м³; ∆ ± 21 % с указанием даты проведения анализа, места отбора пробы, названия лаборатории, юридического адреса организации, ответственного исполнителя и руководителя лаборатории.

13. Контроль погрешности измерений

Контроль погрешности измерений содержания субтилизина (протеазы) проводят на градуировочных растворах в соответствии с пп. 10 и 11. Рассчитывают среднее значение результатов измерения содержания протеазы в градуировочных растворах:

 где

n - число измерений в градуировочной смеси;

C_ni - результат измерения содержания вещества в i-ой пробе градуировочного раствора, мг/дм³.

Рассчитывают среднее квадратичное отклонение измерений концентрации:

Рассчитывают доверительный интервал:

 где

t - коэффициент нормированных отклонений, определяемый по табл. Стьюдента, при доверительной вероятности 0,95, и затем относительную погрешность определения концентраций:

Если δ ≤ 21 %, то погрешность измерения удовлетворительная. Если данное условие не выполняется, то выясняют причину и повторяют измерения.

 

СОДЕРЖАНИЕ