Информационная система
«Ёшкин Кот»

XXXecatmenu

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный

врач Российской Федерации,

Первый заместитель Министра

здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

29 июня 2003 г.

Дата введения: с момента утверждения

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Фотометрическое измерение
массовых концентраций
b-галактозидазы
в воздухе рабочей зоны

Методические указания

 

МУК 4.1.1619-03

 

 

 

1. Область применения

Настоящие методические указания устанавливают количественный фотометрический анализ воздуха рабочей зоны на содержание b-галактозидазы в диапазоне массовых концентраций 2,0 - 20,0 мг/м3.

2. Характеристика вещества

b-галактозидаза представляет собой фермент, получаемый при глубинном культивировании продуцента b-галактозидазы - Penicillium canescens F-178. Обладает специфической b-галактозидазной активностью, которая характеризуется способностью фермента расщеплять b-галактозидазные связи с образованием галактозы.

Препарат предназначен для гидролиза лактозы молока и молочной сыворотки в молочной и хлебопекарной промышленности.

2.1. Физико-химические свойства.

b-галактозидаза - порошок светло-бежевого цвета, хорошо растворимый в воде.

Молекулярная масса - 120 кД.

Ферментативная активность - 5000 Ед/г.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.2. Токсикологическая характеристика.

b-галактозидаза является малотоксичным веществом при поступлении в организм через желудочно-кишечный тракт, обладает слабым раздражающим действием на слизистые оболочки глаз.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) b-галактозидазы в воздухе рабочей зоны 4,0 мг/м3. Класс опасности - III, «А».

3. Погрешность измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений массовых концентраций b-галактозидазы с погрешностью, не превышающей ± 22 %, при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Измерение массовой концентрации b-галактозидазы выполняется методом фотометрии.

Метод основан на определении концентрации орто-нитрофенола, образующегося при действии фермента b-галактозидазы на орто-нитрофенил-b-D-галактопиранозид (НФГ). Измерение концентрации орто-нитрофенола проводят при длине волны 440 нм.

За единицу активности b-галактозидазы принимают такое количество фермента, которое за 1 мин гидролизует 1 мкмоль НФГ в стандартных условиях (30 °С, рН 4,2).

Отбор проб проводят с концентрированием на фильтр.

Нижний предел измерения содержания b-галактозидазы в анализируемой пробе (1,0 см3) - 10,0 мкг.

Нижний предел измерения концентрации b-галактозидазы в воздухе при отборе 50 дм3 - 2,0 мг/м3.

Определению b-галактозидазы не мешает наличие в воздухе инвертазы и ксиланазы.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Колориметр фотоэлектрический КФК-2; длина волны 440 нм, погрешность 0,01D

ТУ 3-3.1766-82

Фотометрическая кювета с толщиной оптического слоя 30 мм

 

Весы лабораторные аналитические ВЛА-200, ± 0,2 мг

ГОСТ 24104-88Е

Весы лабораторные общего назначения не ниже 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г

ГОСТ 24104-88

Ультратермостат, (30,0 ± 0,2) °С

ГОСТ 20790-75

рН-Метр-милливольтметр лабораторный рН-121 (0 - 14 ± 0,1) ед. рН

ТУ 25.05.1689-74

Термометр стеклянный ртутный группы 2

ГОСТ 13646-68

Холодильник бытовой, 4 - 6 °С

ГОСТ 16317-76

Секундомер

ТУ 25-1819.002-90

Бюксы (для взвешивания веществ), СВ 19/9 или СВ 24/10

ГОСТ 25336-82Е

Бюксы (для экстракции b-галактозидазы), СВ 30/45

ГОСТ 7148-70

Стаканы В-1-50С, В-1-100ТС, В-1-250ТС, В-1-500ТС

ГОСТ 25336-82Е

Цилиндры мерные 25-72-06-В-3-7, 100 см3

ГОСТ 1770-74

Колбы мерные 1-го или 2-го исполнения, 25, 50, 100 и 1000 см3

ГОСТ 1770-74Е

Пробирки П-2-16-150 ХС

ГОСТ 25336-82

Пипетки измерительные 1, 2, 5, 10 см3

ГОСТ 29227-91

Аспиратор для отбора проб воздуха модели 822, расход воздуха до 20 дм3/мин

ТУ 64-1-862-82

Фильтродержатель

ТУ 96-72-05-77

Фильтры АФА-ВП-10

ТУ 95-743-80

5.2. Реактивы

b-галактозидаза, активность 5000 ЕД/г, содержание основного вещества не менее 95 %

ТУ 7384-034-19627570-00

Орто-нитрофенил-b-D-галактопиранозид, фирма Sigma (США), САS 369-07-3

 

Натрий углекислый, чда

ГОСТ 83-79

Натрий уксусно-кислый 3-водный, чда

ГОСТ 199-78

Уксусная кислота (ледяная), хч

ГОСТ 61-75

Дистиллированная вода

ГОСТ 6709-72

Допускается применение иных средств измерения, вспомогательных устройств, реактивов и материалов, обеспечивающих показатели точности, установленные для данной МВИ.

6. Требования безопасности

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться меры противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-76.

6.3. При выполнении измерений с использованием фотоэлектроколориметра соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

Работа на фотоэлектроколориметре должна проводиться в чистом помещении, свободном от пыли, паров кислот и щелочей. Вблизи фотоэлектроколориметра не должны располагаться громоздкие изделия, создающие неудобства в работе оператора (ГОСТ 15150-69).

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим и средним специальным образованием, имеющие навыки работы на фотоэлектроколориметре.

8. Условия измерений

8.1. Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5) °С, атмосферном давлении 84 - 106 кПа и влажности воздуха не более 80 %.

8.2. Измерения на фотоэлектроколориметре проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9. Подготовка к выполнению измерений

9.1. Приготовление растворов

9.1.1. Приготовление стандартного раствора b-галактозидазы, 1 г/дм3

Количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 0,1 г b-галактозидазы, объем доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Раствор готовят в день проведения анализа.

9.1.2. Приготовление раствора НФГ (субстрат), 0,01 моль/дм3

Навеску НФГ 0,075 г количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 см3, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Раствор может храниться в холодильнике в течение 3-х суток. Пожелтевший раствор к употреблению непригоден.

9.1.3. Приготовление раствора натрия углекислого, 1 моль/дм3

В мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 106 г натрия углекислого, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Раствор может храниться до 6 месяцев в холодильнике.

9.1.4. Приготовление раствора кислоты уксусной, 0,2 моль/дм3

В мерную колбу вместимостью 1 дм3 вносят 11,6 см3 уксусной кислоты. Доводят до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.

Раствор может храниться до года в посуде с притёртой пробкой.

9.1.5. Приготовление раствора натрия уксусно-кислого, 0,2 моль/л

В мерную колбу вместимостью 1 дм3 вносят 27,2 г натрия уксуснокислого. Доводят до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.

Раствор может храниться до 2-х месяцев в холодильнике.

9.1.6. Приготовление ацетатного буфера, 0,2 моль/дм3, рН 4.2

Смешивают 73,5 см3 раствора уксусной кислоты концентрацией (0,2 моль/дм3) с 26,5 см3 раствора уксусно-кислого натрия (0,2 моль/дм3), тщательно перемешивают. Водородный показатель проверяют на рН-метре.

Раствор можно хранить при комнатной температуре в течение 15 суток.

9.2. Подготовка прибора

Подготовку фотоэлектроколориметра проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

9.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость величины оптической плотности от массы анализируемого вещества в пробе, взятой для анализа, устанавливают при помощи градуировочных растворов b-галактозидазы в соответствии с табл. 1.

Таблица 1

Приготовление растворов для определения градуировочной характеристики b-галактозидазы

№ градуировочного раствора

Объем стандартного раствора b-галактозидазы (1 мг/см3), см3

Объем дистиллированной воды, см3

Содержание b-галактозидазы в объеме пробы (1,0 см3), взятой для анализа, мкг

1

0,0

100,0

0,0

2

1,0

99,0

10,0

3

2,0

98,0

20,0

4

3,0

97,0

30,0

5

4,0

96,0

40,0

6

6,0

94,0

60,0

7

10,0

90,0

100,0

Градуировочные растворы готовятся непосредственно перед измерениями. Хранить не более 6 ч в бытовом холодильнике.

В пробирки наливают по 3,5 см3 ацетатного буфера и 0,5 см3 раствора НФГ (субстратный раствор), прогревают в ультратермостате при 30 °С 10 мин. Затем в пробирки вносят по 1 см3 градуировочных растворов, перемешивают и включают секундомер. Пробирки выдерживают в ультратермостате 10 мин, после чего из них отбирают по 1 см3 в ранее приготовленные пробирки, содержащие по 1 см3 1-молярного раствора углекислого натрия.

Холостую пробу получают путём последовательного добавления в пробирку 3,5 см3 ацетатного буфера, 0,5 см3 раствора НФГ (субстратный раствор) и 1 см3 дистиллированной воды. Пробирки выдерживают в ультратермостате 10 мин. Далее отбирают 1 см3 в подготовленную пробирку, содержащую 1 см3 1-молярного раствора углекислого натрия.

Во все пробирки добавляют по 8 см3 дистиллированной воды. В результате общий объем жидкости в каждой пробирке составляет 10 см3.

Холостая проба практически бесцветна. Растворы, содержащие b-галактозидазу, имеют желтую окраску, интенсивность которой тем сильнее, чем выше концентрация определяемого вещества.

Измеряют оптическую плотность растворов в кюветах с толщиной оптического слоя 30 мм при длине волны 440 нм по отношению к холостой пробе, не содержащей определяемого вещества (раствор № 1 по таблице).

Строят градуировочный график зависимости значения оптической плотности (при длине волны 440 нм, в кюветах толщиной оптического слоя 30 мм) от концентрации b-галактозидазы.

Рабочая зона оптического поглощения для градуировочного графика лежит в пределах 0,1 - 1,1.

Для построения каждой точки градуировочного графика вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности из пяти параллельных измерений.

Проверку градуировочного графика проводят 1 раз в 3 месяца или в случае смены партии реактивов, оборудования или приборов.

9.4. Отбор проб воздуха

Воздух с объемным расходом 10 дм3/мин аспирируют в течение 5 мин через фильтр АФА-ВП-10, помещенный в фильтродержатель. Для определения 1/2 ПДК b-галактозидазы следует отобрать 50 дм3 воздуха.

Отобранные пробы хранятся в условиях сухого помещения в закрытом сосуде при комнатной температуре до 5 суток.

10. Выполнение измерения

10.1. Экстракция b-галактозидазы с фильтра

Фильтр с отобранной пробой переносят в бюкс, приливают в него 5 см3 дистиллированной воды и оставляют на 10 мин, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Полученный раствор отливают в пробирку, а экстракцию продолжают, добавив в стаканчик с фильтром 5 см3 раствора дистиллированной воды. Затем фильтр тщательно отжимают и удаляют. Растворы сливают в одну пробирку. Таким образом получают 10 см3 элюата b-галактозидазы.

Степень десорбции b-галактозидазы с фильтра (Кд) равняется 97 %.

10.2. Проведение анализа

Анализ 1,0 см3 элюата на содержание b-галактозидазы проводят точно так же, как при построении градуировочной характеристики.

Оптическую плотность анализируемого раствора измеряют аналогично градуировочным растворам по сравнению с холостым, который готовят одновременно и аналогично пробам, используя чистый фильтр.

По градуировочному графику находят количество b-галактозидазы в объеме пробы, взятой для анализа, соответствующее полученным значениям оптических плотностей.

Если значения оптических плотностей находятся за пределами рабочей зоны градуировочного графика, то опыт необходимо повторить с раствором, имеющим большее или меньшее содержание b-галактозидазы.

11. Расчет концентрации вещества в воздухе

Массовую концентрацию b-галактозидазы в воздухе (С, мг/м3) вычисляют по формуле:

 (мг/м3), где

а - содержание b-галактозидазы, найденное в анализируемом объеме раствора по градуировочному графику, мкг;

б - объем пробы, взятой для анализа, см3;

в - общий объем пробы, см3;

V - объем воздуха, отобранного для анализа и приведенного к стандартным условиям, дм3 (см. прилож. 1).

12. Оформление результатов анализа

Результат количественного анализа представляют в виде (С ± С · D/100) мг/м3, Р = 0,95, где D - характеристика погрешности, выраженная в процентах.

13. Контроль погрешности методики

Значения полученных метрологических характеристик погрешности, норматива оперативного контроля точности и норматива оперативного контроля воспроизводимости приведены в табл. 2.

Таблица 2

Результаты метрологической аттестации фотометрической методики

Наименование метрологической характеристики

Диапазон определяемых массовых концентраций b-галактозидазы, мг/м3

Характеристика погрешности D, % (Р = 0,95)

Норматив оперативного контроля погрешности К, % (Р = 0,90, т = 2)

Норматив оперативного контроля воспроизводимости (Р = 0,95, т = 2)

2 - 20

22

18

22

13.1. Оперативный контроль воспроизводимости

Оперативный контроль воспроизводимости выполняют в одной серии с анализом рабочих проб. Отбирают реальные пробы воздуха рабочей зоны из одного традиционного места отбора двумя пробоотборниками одновременно. Анализируют в соответствии с прописью методики, максимально варьируя условия проведения анализа: партии реактивов, набора мерной посуды и т.д., и получают два результата С1 и С2 анализов. Результаты анализа не должны отличаться друг от друга на величину, большую, чем норматив оперативного контроля воспроизводимости D (%):

При превышении расхождения между двумя результатами норматива оперативного контроля воспроизводимости эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

13.2. Оперативный контроль точности

Внутренний оперативный контроль точности проводят для каждого интервала определяемых концентраций. Единичные контрольные измерения выполняют в одной серии с КХА рабочих проб за период, в течение которого условия проведения КХА допустимо считать постоянными. Число контрольных измерений зависит от установленных планов статистического контроля точности.

Образцами для оперативного контроля точности являются стандартные образцы с известным содержанием измеряемого вещества, величина которого должна быть близкой к анализируемым пробам.

При контроле качества результатов КХА состава воздушных сред при отсутствии в лаборатории промышленных смесей или невозможности их создания, в качестве образца для контроля используют стандартный образец, нанесенный на фильтр или другое устройство, на которое концентрируют исследуемые вещества. При этом следует иметь в виду, что погрешность процедуры отбора проб контролируется путем поверки используемых пробоотборников, и расчет норматива контроля точности осуществляют, исходя из характеристики погрешности методики КХА за вычетом характеристики погрешности используемого пробоотборника и характеристики погрешности, связанной с неполным извлечением анализируемых компонентов.

Решение об удовлетворительной погрешности принимают при выполнении условия:

Соа - содержание (концентрация) анализируемого вещества в образце для анализа (по приготовлению), мг/м3;

Х - измеренное содержание (концентрация) вещества, мг/м3;

K - величина характеристики оперативного контроля точности, %.

14. Нормы затрат времени на анализ

Для проведения анализа требуется 2,5 ч.

Методические указания разработаны Российским государственным медицинским университетом (А.В. Лиманцев).

Приложение 1

Приведение объема воздуха к стандартным условиям

Приведение объема воздуха к стандартным условиям (температура 20 °С и давление 101,33 кПа) проводят по формуле:

, где

Vt - объем воздуха, отобранного для анализа, дм3;

Р - барометрическое давление, кПа (101,33 кПа = 760 мм рт. ст.);

t - температура воздуха в месте отбора пробы, °С.

Для удобства расчета V20 следует пользоваться таблицей коэффициентов (прилож. 2). Для приведения воздуха к стандартным условиям надо умножить Vt на соответствующий коэффициент.

Приложение 2

Коэффициенты для приведения объема воздуха к стандартным условиям

Давление Р, кПа/мм рт. ст.

t °C

97,33/730

97,86/734

98,4/738

98,93/742

99,46/746

100/750

100,53/754

101,06/758

101,33/760

101,86/764

-30

1,1582

1,1646

1,1709

1,1772

1,1836

1,1899

1,1963

1,2026

1,2058

1,2122

-26

1,1393

1,1456

1,1519

1,1581

1,1644

1,1705

1,1768

1,1831

1,1862

1,1925

-22

1,1212

1,1274

1,1336

1,1396

1,1458

1,1519

1,1581

1,1643

1,1673

1,1735

-18

1,1036

1,1097

1,1158

1,1218

1,1278

1,1338

1,1399

1,1460

1,1490

1,1551

-14

1,0866

1,0926

1,0986

1,1045

1,1105

1,1164

1,1224

1,1284

1,1313

1,1373

-10

1,0701

1,0760

1,0819

1,0877

1,0986

1,0994

1,1053

1,1112

1,1141

1,1200

-6

1,0540

1,0599

1,0657

1,0714

1,0772

1,0829

1,0887

1,0945

1,0974

1,1032

-2

1,0385

1,0442

1,0499

1,0556

1,0613

1,0669

1,0726

1,0784

1,0812

1,0869

0

1,0309

1,0366

1,0423

1,0477

1,0535

1,0591

1,0648

1,0705

1,0733

1,0789

+2

1,0234

1,0291

1,0347

1,0402

1,0459

1,0514

1,0571

1,0627

1,0655

1,0712

+6

1,0087

1,0143

1,0198

1,0253

1,0309

1,0363

1,0419

1,0475

1,0502

1,0557

+10

0,9944

0,9999

0,0054

1,0108

1,0162

1,0216

1,0272

1,0326

1,0353

1,0407

+14

0,9806

0,9860

0,9914

0,9967

1,0027

1,0074

1,0128

1,0183

1,0209

1,0263

+18

0,9671

0,9725

0,9778

0,9830

0,9884

0,9936

0,9989

1,0043

1,0069

1,0122

+20

0,9605

0,9658

0,9711

0,9783

0,9816

0,9868

0,9921

0,9974

1,0000

1,0053

+22

0,9539

0,9592

0,9645

0,9696

0,9749

0,9800

0,9853

0,9906

0,9932

0,9985

+24

0,9475

0,9527

0,9579

0,9631

0,9683

0,9735

0,9787

0,9839

0,9865

0,9917

+26

0,9412

0,9464

0,9516

0,9566

0,9618

0,9669

0,9721

0,9773

0,9799

0,9851

+28

0,9349

0,9401

0,9453

0,9503

0,9555

0,9605

0,9657

0,9708

0,9734

0,9785

+30

0,9288

0,9339

0,9391

0,9440

0,9432

0,9542

0,9594

0,9645

0,9670

0,9723

+34

0,9167

0,9218

0,9268

0,9318

0,9368

0,9418

0,9468

0,9519

0,9544

0,9595

+38

0,9049

0,9099

0,9149

0,9199

0,9248

0,9297

0,9347

0,9397

0,9421

0,9471

Приложение 3

Указатель основных синонимов, технических, торговых и фирменных названий веществ

1. Амиодарон

2. Амоксициллина тригидрат

3. Ацикловир

4. Витамин А

5. Галоперидол

6. Ксиланаза

7. Лоперамида гидрохлорид

8. Мексидол

9. Мексикор

10. Офлоксацин

11. Пиразинамид

12. Ретинола ацетат

13. Родопол-23

14. Симвастатин

15. Трамадол

16. Хладон-23

17. Хладон-31-10

18. Хладон-116

19. Хладон-122

20. Хладон-R11511

21. Цианборгидрид натрия

22. Этамбутола дигидрохлорид

Приложение 4

Вещества, определяемые по ранее утвержденным методическим указаниям

Название вещества

Ссылка на опубликованные методические указания

1

2

1. №-децил-N,N-диметил-1-деканаминий хлорид (дидецилдиметиламмоний хлорид; «Арквад 2.10.50»)

МУ по фотометрическому измерению концентраций диалкилдиметиламмоний хлорида (С17 - С20) и алкилбензилдиметиламмоний хлорида (С10 - С16)-ДОН-2, диалкиламинопропионитрила (С7 - С9)-ИФХАН-ГАЗ, алкилтриметиламмоний хлорида (С10 - С16), ДОН-52 в воздухе рабочей зоны. № утв. 4905-88, дата утв. 12.12.88, вып. 25. М., 1989, с. 49

2. Поликарбонофторид

МУ на гравиметрическое определение пыли в воздухе рабочей зоны и в системах вентиляционных установок. МУ № 1719-77, дата утв. 18.04.77, вып. 1 - 5. М., 1981, с. 235

3. Препарат МЭК-Сх-3

МУ по фотометрическому измерению массовых концентраций эндо-1,3в-ксиланазы (ксиланаза) в воздухе рабочей зоны. МУК 4.1.1642-03, дата утв. 29.06.03, вып. 42

4. Препарат ПФП-1

МУ по спектрофотометрическому измерению концентрации амилазы в воздухе рабочей зоны. МУК 4.1.1575-03, дата утв. 29.06.03, вып. 38

5. Препарат Феркон

МУ по фотометрическому измерению массовых концентраций целловиридина в воздухе рабочей зоны. МУК 4.1.1753-03, дата утв. 29.06.03, вып. 46

6. Селенит натрия

МУ по атомно-абсорбционному измерению массовых концентраций селена и диоксида селена в воздухе рабочей зоны. МУК 4.1.1368-03, дата утв. 16.05.03, вып. 41

7. Триамин G-12Д

МУ по спектрофотометрическому измерению концентраций N’, N’-бис-(3-аминопропил)-додециламина(лонзабака) в воздухе рабочей зоны. МУК 4.1.1522-03, дата утв. 29.06.03, вып. 37

 

СОДЕРЖАНИЕ

1. Область применения. 1

2. Характеристика вещества. 1

3. Погрешность измерений. 1

4. Метод измерений. 1

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы.. 2

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы.. 2

5.2. Реактивы.. 2

6. Требования безопасности. 2

7. Требования к квалификации операторов. 3

8. Условия измерений. 3

9. Подготовка к выполнению измерений. 3

9.1. Приготовление растворов. 3

9.2. Подготовка прибора. 4

9.3. Установление градуировочной характеристики. 4

9.4. Отбор проб воздуха. 5

10. Выполнение измерения. 5

10.1. Экстракция b-галактозидазы с фильтра. 5

10.2. Проведение анализа. 5

11. Расчет концентрации вещества в воздухе. 5

12. Оформление результатов анализа. 5

13. Контроль погрешности методики. 5

13.1. Оперативный контроль воспроизводимости. 6

13.2. Оперативный контроль точности. 6

14. Нормы затрат времени на анализ. 7

Приложение 1. Приведение объема воздуха к стандартным условиям.. 7

Приложение 2. Коэффициенты для приведения объема воздуха к стандартным условиям.. 7

Приложение 3. Указатель основных синонимов, технических, торговых и фирменных названий веществ. 7

Приложение 4. Вещества, определяемые по ранее утвержденным методическим указаниям.. 8

 

 



© 2013 Ёшкин Кот :-)