Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации

Государственные санитарно-эпидемиологические
правила и гигиенические нормативы

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма
Trichoderma viride 44-11-62/3 - продуцента
комплекса целлюлолитических ферментов
в воздухе рабочей зоны

Методические указания

МУК 4.2.1784-03

МИНЗДРАВ РОССИИ

МОСКВА 2004

Методические указания. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.

1. Разработаны: Российским государственным медицинским университетом (к.б.н. Н.И. Шеиной).

2. Утверждены Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24 октября 2003 г.

3. Введены в действие с 1 декабря 2003 г.

4. Введены впервые.

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный

врач Российской Федерации,

Первый заместитель Министра

здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

24 октября 2003 г.

Дата введения: 1 декабря 2003 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Trichoderma viride 44-11-62/3 - продуцента комплекса целлюлолитических ферментов в воздухе рабочей зоны

Методические указания

МУК 4.2.1784-03

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма - Trichoderma viride 44-11-62/3 продуцента комплекса целлюлолитических ферментов (целлюлаза, ксиланаза) в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 м³ воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

2. Характеристика штамма-продуцента Trichoderma viride 44-11-62/3

На агаризованной среде сусло-агар (содержание солодового сусла 5 - 6° по Баллингу) на 5 день развития микроорганизм образует характерные колонии до 5 - 5,5 см в диаметре с гладкой подошвой, слегка приподнятые над поверхностью среды, не врастающие в агар, с волнистым краем, пушистым воздушным мицелием, который покрыт спорами лимонно-желтого цвета. На 3 день развития в среду выделяется ярко-желтый пигмент лимонного оттенка. Гифы мицелия бесцветные, септированные, многократно ветвистые.

Систематическое положение микроорганизма.

Класс Fungi imperfecti

Порядок Hyphomycetales

Род Trichoderma

Вид viride

Штамм 44-11-62/3

Штамм Trichoderma viride 44-11-62/3 получен во ВНИИбиотехнология в лаборатории Биосинтеза ферментов методом индуцированной селекции с применением этиленимина и нитрозометилмочевины из исходной культуры Trichoderma viride 44 - продуцента целлюлазы и депонирован в ЦМПМ ВНИИгенетика.

Штамм-продуцент синтезирует высокоактивный комплекс целлюлолитических ферментов для производства ферментного препарата целловиридин Г3х. Максимальная активность целлюлазы составляет 35 ед./мл, ксиланазы - 42 ед./мл.

Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованных средах. Культивирование гриба происходит 5 суток при температуре 36 - 38 °С, затем 5 суток при комнатной температуре. Для размножения и хранения используется сусло-агар 5 - 6 °Б. рН среды - 5,0 - 6,0.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 2000 кл./м³, А.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Прямой метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток (спор, фрагментов мицелия) на поверхность плотной питательной среды сусло-агар и подсчета выросших колоний по культурально-морфологическим признакам на день развития.

Косвенный метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток на поверхность плотной питательной селективной среды и подсчета выросших колоний по зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма как результат продукции целлюлазы на среде с окрашенной целлюлозой.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Прибор для бактериологического анализа

воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77

Термостаты электрические суховоздушные

или водяные

Автоклав электрический ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной

системой типа «Биолам» Л-211

Лупа с увеличением ´ 10 ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные,

стеклянные, диаметром 100 мм

Пробирки биологические, вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 10515-75

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74

Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74

Секундомер ГОСТ 9586-75

Барометр ГОСТ 24696-79

Марля медицинская ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81

5.2. Реактивы, растворы

Агаризованное пивное сусло 5 - 6 °Б для штамма-

продуцента (агар - 1,8 %, рН 5,0 - 6,0,

режим стерилизации 1,1 - 1,2 ати в течение 30 мин)

Молочная кислота, синоним-альфа-оксипролиновая

кислота (из расчета 0,4 мл на 100 мл среды

сусло-агар для подавления посторонней бактериальной

микрофлоры) ГОСТ 490-79

Бенгальский розовый

Диметилсульфоксид

Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67

Селективная среда для штамма-продуцента.

Состав среды: КН₂РО₄ - 1 г; MgSO₄×7H₂О - 0,5 г;

(NH₄)₂SO₄ - 0,7 г; целлюлоза порошковая

в пересчете на сухое вещество - 0,9 г; лактоза -0,3 г;

дрожжевой экстракт - 0,5 г; агар - 18 г;

вода дистиллированная - до 1000 мл

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования:

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. Руководство «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980), «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованным бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5 °С), атмосферном давлении 630 - 800 мм рт.ст. и влажности воздуха не более 80 %.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток штамма-продуцента воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента (прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента, косвенный - до 30 - 50 колоний на чашке).

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки.

На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо.

После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методом среду сусло-агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °С, добавляют молочной кислоты из расчета 0,4 мл на 100 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

При выполнении анализа воздуха рабочей зоны косвенным методом селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/л бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 42 °С (для интенсификации развития). Через 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам и характерной пигментации среды (прямой метод) или зон просветления вокруг выросших колоний продуцента (косвенный метод) как результат продукции целлюлолитических ферментов на среде с окрашенной целлюлозой.