СОВЕТ ЭКОНОМИЧЕСКОЙ ВЗАИМОПОМОЩИ

 

СТАНДАРТ СЭВ

 

СТ СЭВ 4156-83

СРЕДСТВА МОЮЩИЕ СИНТЕТИЧЕСКИЕ
ЭНЗИМОСОДЕРЖАЩИЕ

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТИ

1986

Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 24 апреля 1984 г. № 1400 стандарт Совета Экономической Взаимопомощи СТ СЭВ 4156-83 «Средства моющие синтетические энзимосодержащие. Метод определения протеолитической активности» введен в действие непосредственно в качестве государственного стандарта СССР

в договорно-правовых отношениях по сотрудничеству

с 01.07.85

Утвержден Постоянной Комиссией по сотрудничеству
в области стандартизации

Прага, июль 1983 г.

1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1.1. Для испытания применяют реактивы квалификации х.ч., или ч.д.а. и дистиллированную воду или воду такой же чистоты.

1.2. Все указанные реактивы взвешивают с погрешностью не более 0,01 g.

2. СУЩНОСТЬ МЕТОДА

Метод заключается в гидролизе белкового субстрата (казеина) при рН 10,5 и температуре 40 °С и колориметрическом определении содержания образовавшегося в гидролизате тиразина с реактивом Фолина.

3. АППАРАТУРА И МАТЕРИАЛЫ

3.1. Ультратермостат, обеспечивающий температуру нагрева (40 ± 0,1) °С.

3.2. рН-метр.

3.3. Мешалка магнитная.

3.4. Фотоэлектроколориметр.

3.5. Воронки стеклянные диаметром от 5 до 7 mm.

3.6. Баня водяная.

3.7. Пробирки стеклянные диаметром от 15 до 19 mm, высотой от 150 до 180 mm.

3.8. Бумага индикаторная (калийно-йодистая).

4. РЕАКТИВЫ И РАСТВОРЫ

4.1. Казеин по Гаммерстену.

4.2. Натрия гидроокись, раствор концентрации с (NaOH) = 1 mol/dm³ (1 н.), готовят по СТ СЭВ 3674-82.

4.3. Натрий вольфрамовокислый (Na₂WoО₄×2H₂О).

4.4. Натрий молибденовокислый (Na₂MoО₄×2H₂О).

4.5. Кислота фосфорная орто, плотность, 1,698 g/cm³.

4.6. Кислота соляная концентрированная.

4.7. Литий сернокислый (Li₂SО₄).

4.8. Бром.

4.9. Натрий двууглекислый, раствор с (NaHCО₃) = 0,2 mol/dm³; готовят следующим образом: взвешивают 16,8 g двууглекислого натрия, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 cm³ и доводят водой до метки.

4.10. Натрий углекислый, раствор с (Na₂CO₃) = 0,2 mol/dm³; готовят следующим образом: взвешивают 21,2 g безводного углекислого натрия, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 cm³ и доводят водой до метки.

4.11. Раствор буферный; готовят следующим образом: в мерную колбу вместимостью 200 cm³ помещают 45 cm³ раствора углекислого натрия, 5 cm³ раствора двууглекислого натрия, наливают 150 cm³ воды и перемешивают.

4.12. Казеин, 1 %-ный раствор (субстрат); готовят следующим образом: взвешивают 2 g казеина по Гаммерстену с погрешностью не более 0,0001 g, переносят в коническую колбу вместимостью 300 cm³ и приливают 140 cm³ буферного раствора рН = 10,7. Колбу ставят на магнитную мешалку и раствор перемешивают в течение 30 min. Затем, продолжая перемешивать раствор, колбу с казеином помещают в водяную баню при 70 °С для полного растворения и нагревают раствор до 40 °С и при этой температуре доводят рН до 10,5 добавлением раствора гидроокиси натрия. После этого раствор казеина переводят из конической колбы в мерную колбу вместимостью 200 cm³ и доводят объем буферным раствором до 180 - 190 cm³. Далее раствор казеина охлаждают проточной водой до 20 °С и объем его доводят до 200 cm³ буферным раствором. Срок хранения приготовленного раствора казеина в холодильнике не более 2 d.

4.13. Раствор Фолина основной; готовят следующим образом: в колбу вместимостью 1500 cm³ наливают 700 cm³ воды, добавляют 100 g вольфрамовокислого натрия и 25 g молибденовокислого натрия. Затем приливают 50 см³ ортофосфорной кислоты и 100 cm³ концентрированной соляной кислоты. Раствор кипятят в течение 10 h с обратным холодильником. Далее раствор охлаждают и в охлажденный раствор добавляют 150 g сернокислого лития, 50 cm³ воды и 4 - 5 капель брома. После этого раствор снова кипятят с обратным холодильником, чтобы удалить избыток брома (проверка индикаторной бумагой). Раствор должен иметь желтую окраску. Если цвет раствора зеленый, то обработку бромом надо повторить.

После того, как раствор остынет, добавляют воду до объема 1000 cm³ и фильтруют через фильтровальную бумагу. Раствор хранят в темной склянке в холодильнике. Через 2 - 3 мес хранения в раствор добавляют 1 - 2 капли брома и снова кипятят. Срок годности основного раствора Фолина не более года. Показателем непригодности раствора является его помутнение и изменение окраски на зеленую. Рабочий раствор готовят перед проведением испытания из основного путем разбавления его водой в соотношении 1 + 3.

4.14. Кислота трихлоруксусная, раствор с (ССl₃СООН) = 0,3 mol/dm³; готовят следующим образом: взвешивают 49,05 g трихлоруксусной кислоты, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 cm³ и доводят объем водой до метки.

4.15. Натрий углекислый, раствор с (Na₂СО₃) = 0,5 mol/dm³; готовят следующим образом: взвешивают 53 g углекислого натрия, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 cm³ и доводят объем водой до метки.

5. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

Приготовление раствора испытуемого моющего средства.

Взвешивают 10 g испытуемого моющего средства, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 cm³ и доводят объем водой до метки. Из полученного раствора берут 25 cm³, помещают в мерную колбу вместимостью 100 cm³ и доводят объем раствора водой до метки. Разведение повторяют до тех пор, пока в последнем разведении количество препарата щелочной протеазы в 2 cm³ реакционной смеси не превысит 0,75 - 1,0 mg.

6. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

В первую пробирку (контрольную) наливают 5 cm³ раствора казеина и выдерживают в ультратермостате при 40 °C в течение 5 min. В эту пробирку добавляют 2,5 cm³ воды, перемешивают и опять помещают в ультратермостат, где выдерживают при 40 °С в течение 60 min. Затем берут пробирки в количестве, соответствующем количеству разведений основного раствора, и в каждую из них наливают по 5 cm³ раствора казеина, причем каждое разведение анализируют в двух повторностях. Пробирки выдерживают в ультратермостате при 40 °С в течение 5 min, добавляют в каждую из них по 2,5 cm³ испытуемого раствора, перемешивают и выдерживают в ультратермостате при 40 °С в течение 60 min.

По окончании гидролиза в каждую из пробирок, начиная с контрольной, добавляют по 5 cm³ раствора трихлоруксусной кислоты, чтобы прервать реакцию и осадить непрогидролизированный казеин. Смесь быстро перемешивают и выдерживают в ультратермостате при 40 °С в течение 15 min для полного осаждения. Затем раствор фильтруют через фильтровальную бумагу и в фильтрате определяют количество прогидролизованного белка по содержанию образовавшегося тиразина. Для этого наливают по 2 cm³ фильтрата в пробирки и медленно прибавляют в каждую пробирку по 5 cm³ раствора углекислого натрия концентрации с (Na₂СО₃) = 0,5 mol/dm³ и по 1 cm³ рабочего раствора Фолина. Полученный раствор выдерживают в ультратермостате при 40 °С в течение 30 min до появления синей окраски. Затем раствор охлаждают до комнатной температуры и измеряют оптическую плотность испытуемых растворов по отношению к контрольной пробе на фотоэлектроколориметре при длине волны 656 - 677 min в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 5 mm.

7. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИСПЫТАНИЯ

7.1. Протеолитическую активность (X) в единицах ФОЛП на 1 g моющего средства вычисляют по формуле

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

m - содержание энзима в 2 cm³ фильтрата, mg;

4,7 и 0,1 - постоянные коэффициенты, полученные экспериментально;

1000 - переводной коэффициент mg в g.

7.2. Относительная погрешность определения не превышает ±5 %.

7.3. За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое значение результатов, полученных при испытании двух параллельных проб испытуемого моющего средства.

ИНФОРМАЦИОННОЕ ПРИЛОЖЕНИЕ

ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ

За единицу протеолитической активности принимают такое количество энзима, которое катализирует гидролиз 1 g белка (казеина) при расщеплении его на 30 % в принятых условиях (температура 40 °С, рН = 10,5, продолжительность гидролиза 60 min).

 

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

 

1. Автор - делегация ВНР в Постоянной Комиссии по сотрудничеству в области химической промышленности.

2. Тема - 14.550.20-80.

3. Стандарт СЭВ утвержден на 53-м заседании ПКС.

4. Сроки начала применения стандарта СЭВ:

5. Срок первой проверки - 1990 г., периодичность проверки - 5 лет.

 

СОДЕРЖАНИЕ