3. Метод измерений

Метод основан на экстракции имидаклоприда из репки и зеленой массы лука водным раствором ацетона, очистке экстрактов от коэкстрактивных компонентов распределением веществ в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем, разделении компонентов очищенных экстрактов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с последующим измерением содержания имидаклоприда с использованием ультрафиолетового детектора и обработкой хроматограмм методом абсолютной градуировки.

4. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

4.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны, снабженный дегазатором и термостатом колонки
Весы аналитические с пределом взвешивания до 110 г и допустимой погрешностью 0,0001 г	ГОСТ Р 53228-08
Весы лабораторные с пределом взвешивания до 160 г и допустимой погрешностью 0,005 г	ГОСТ Р 53228-08
Колбы мерные 2-100-2, 2-1000-2	ГОСТ 1770-74
Пипетки градуированные 1-1-2-1, 1-1-2-2, 1-2-2-5, 1-2-2-10	ГОСТ 29227-91
Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой П-2-5-0,1; П-2-10-0,2	ГОСТ 1770-74
Цилиндры мерные 1-25, 1-50, 1-100, 1-500, 1-1000	ГОСТ 1770-74
Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 20 - 100 мм³

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.2. Реактивы

Имидаклоприд, аналитический стандарт с содержанием основного вещества 99,6 %
Ацетон, осч	ТУ 6-09-3513-86
Ацетонитрил для хроматографии, хч	ТУ 6-09-3534-87
Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, деионизованная)
н-Гексан, хч	ТУ 6-09-3375-78
Калий углекислый, хч	ГОСТ 4221-76
Калия перманганат, хч	ГОСТ 20490-75
Кальция хлорид, хч	ГОСТ 4161-77
Кислота ортофосфорная, хч, 85 %	ГОСТ 6552-80
Кислота серная концентрированная, хч	ГОСТ 4204-77
Метилен хлористый (дихлорметан), хч	ТУ 6-09-2662-77
Натрий серно-кислый безводный, хч	ГОСТ 4166-76
Натрий углекислый, хч	ГОСТ 83-79
Фосфор (V) оксид (пентоксид фосфора), хч	ТУ 6-09-4173-85
Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат), хч	ГОСТ 22300-76

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

4.3. Вспомогательные устройства, материалы

Ванна ультразвуковая с рабочей частотой 35 кГц
Гомогенизатор с металлическим стаканом вместимостью не менее 500 см³ и скоростью вращения ножа не менее 10000 об./мин
Воронка Бюхнера	ГОСТ 9147-80
Воронки делительные вместимостью 100 и 250 см³	ГОСТ 25336-82
Воронки лабораторные, стеклянные	ГОСТ 25336-82
Колба Бунзена вместимостью 250 см³	ГОСТ 25336-82
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10 и 150 см³	ГОСТ 9737-93
Колонка хроматографическая стеклянная, длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм
Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар
Силикагель для колоночной хроматографии с размером частиц 0,063 - 0,200 мм и размером пор 60А
Стаканы химические вместимостью 100 и 500 см³	ГОСТ 25336-82
Стекловата
Установка для перегонки растворителей с дефлегматором	ГОСТ 9737-93 (ИСО 641-75)
Фильтры бумажные средней плотности	ТУ 6-09-1678-86
Фильтры мембранные, диаметром 47 мм с размером пор 0,45 мкм
Хроматографическая колонка стальная, длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми многофункциональными полярными группами С18, зернением 5 мкм

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5. Требования безопасности, охраны окружающей среды

5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, 12.1.005-88.

5.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90. Обучение работников правилам безопасности труда проводят согласно ГОСТ 12.0.004-90.

5.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ Р 12.1.019-09 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

6. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускается специалист, прошедший обучение, имеющий опыт работы в лаборатории и владеющий техникой проведения хроматографического анализа, освоивший данную методику и подтвердивший соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7. Требования к условиям измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

7.1. Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу

- температура воздуха	(20 ± 5) °С;
- атмосферное давление	(84 - 106) кПа;
- относительная влажность воздуха	не более 80 %.

7.2. Условия хроматографического анализа

Температура колонки: 27 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил-0,005 М раствор ортофосфорной кислоты (с объемным соотношением компонентов 25:75).

Скорость потока элюента: 0,6 см³/мин.

Рабочая длина волны: 268 нм.

Объем вводимой пробы: 5 мм³.

Линейный диапазон детектирования: 0,1 - 1,0 нг.

8. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, раствора внесения, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, градуировка хроматографа, приготовление смеси растворителей для очистки экстрактов на колонке, подготовка колонки с силикагелем, проверка хроматографического поведения имидаклоприда на колонке.

8.1. Подготовка органических растворителей и приготовление растворов

8.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют. Перед использованием ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным углекислым калием (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г углекислого калия). Срок хранения - 1 неделя.

8.1.2. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным углекислым калием. Срок хранения - 1 неделя.

8.1.3. Очистка хлористого метилена

Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5 %

Навеску (5,0 ± 0,1) г натрия углекислого растворяют в конической колбе в (40 - 60) см³ деионизованной воды. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем раствора до метки деионизованной водой. Срок хранения раствора - 1 неделя.

Растворитель промывают последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5 %, насыщенным раствором хлорида кальция, сушат над безводным углекислым калием и перегоняют. Срок хранения - 1 неделя.

8.1.4. Очистка ацетона

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и калием углекислым (на 1 дм³ ацетона 10 г перманганата калия и 2 г калия углекислого). Срок хранения - 1 неделя.

8.2. Приготовление раствора углекислого калия с молярной концентрацией 0,05 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 6,9 г калия углекислого, приливают 100 см³ бидистиллированной воды, перемешивают до растворения осадка, доводят объем раствора бидистиллированной водой до метки, перемешивают. Срок хранения - 1 неделя.

8.3. Приготовление растворов ортофосфорной кислоты

Для приготовления раствора ортофосфорной кислоты с молярной концентрацией 1 моль/дм³ (1 М раствор) в мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 6,9 см³ ортофосфорной кислоты, доводят объем раствора бидистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

Для приготовления раствора ортофосфорной кислоты с молярной концентрацией 0,005 моль/дм³ (0,005 М раствор) в мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 5 см³ 1 М раствора ортофосфорной кислоты, доводят объем раствора бидистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

8.4. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 250 см³ ацетонитрила, вносят 750 см³ 0,005 М водного раствора ортофосфорной кислоты (п. 8.3), перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.

8.5. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой для ВЭЖХ, приготовленной по п. 8.4, при скорости подачи растворителя 0,5 см³/мин не менее 2 часов до установления стабильной базовой линии (дрейф базовой линии в течение 1 часа не более 5 %, а уровень шумов не более 2 % диапазона выходного сигнала на шкале измерений).

8.6. Приготовление градуировочных растворов

8.6.1. Исходный градуировочный раствор имидаклоприда с массовой концентрацией 100 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают (0,0100 ± 0,0001) г имидаклоприда, растворяют в 40 - 50 см³ ацетонитрила, доводят объем раствора ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °С в течение трех месяцев.

8.6.2. Градуировочный раствор имидаклоприда с массовой концентрацией 10 мкг/см³ (раствор № 1). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора имидаклоприда с массовой концентрацией 100 мкг/см³ (п. 8.6.1), доводят объем раствора ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают. Этот раствор используют для приготовления градуировочных растворов № 2 - 5, а также для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом «внесено-найдено» и контроле точности методом добавок.

Градуировочный раствор № 1 хранят при температуре не выше минус 18 °С в течение месяца.

8.6.3. Градуировочные растворы имидаклоприда с массовой концентрацией 0,02 - 0,2 мкг/см³ (растворы № 2 - 5). В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 0,2; 0,4; 1,0 и 2,0 см³ градуировочного раствора имидаклоприда с массовой концентрацией 10 мкг/см³ (п. 8.6.2), доводят объем раствора до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 8.4, тщательно перемешивают, получают растворы № 2 - 5 с массовой концентрацией имидаклоприда 0,02; 0,04; 0,1 и 0,2 мкг/см³ соответственно.

Растворы хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °С в течение недели.

8.7. Градуировка хроматографа

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мкВ∙с) от массовой концентрации имидаклоприда в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной градуировки по 4 градуировочным растворам (п. 8.6.3).

В инжектор хроматографа вводят по 5 мм³ каждого градуировочного раствора (п. 8.6.3) и анализируют при условиях п. 7.2. Осуществляют не менее 3 параллельных определений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предела повторяемости r.

По полученным данным строят градуировочную характеристику.

8.8. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

(1)

X - содержание имидаклоприда в пробе при контрольном измерении, мкг;

С - известное содержание имидаклоприда в градуировочном растворе, взятом для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг;

В - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10 % при Р = 0,95).

Если величина расхождения (А) превышает 10 %, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново согласно п. 8.5.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

8.9. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 3 г силикагеля в 15 см³ смеси гексан-ацетон в объемном соотношении 7:3. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного серно-кислого натрия высотой 1 см. Колонку промывают 10 см³ вышеприведенной смеси со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

8.10. Определение объема элюента, необходимого для полного вымывания имидаклоприда из колонки с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 0,1 см³ стандартного раствора имидаклоприда с концентрацией 10 мкг/см³ (п. 8.6.2), упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 35 °С. Сухой остаток растворяют в 3 см³ смеси гексан-ацетон в объемном соотношении 7:3, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 8.9. Колбу обмывают 3 см³ этой же смеси растворителей, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 40 см³ смеси гексан-ацетон в объемном соотношении 7:3, элюат отбрасывают. Затем через колонку пропускают 60 см³ смеси гексан-ацетон (7:3, по объему), отбирая последовательно по 10 см³ элюата. Каждую фракцию упаривают досуха, остатки растворяют в 2 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 8.4) и анализируют на содержание имидаклоприда по п. 7.2.

Фракции, содержащие имидаклоприд, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 10 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 7.2. Определяют полноту смывания вещества с колонки и объем элюента, необходимый для полного вымывания имидаклоприда из колонки.

Примечание. Проверку хроматографического поведения имидаклоприда на колонке следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

9. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ 1723-86 «Лук репчатый свежий заготовляемый и поставляемый. Технические условия», ГОСТ Р 51783-01 «Лук репчатый свежий, реализуемый в розничной торговой сети. Технические условия», «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79).

Пробы зеленой массы и репки хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 5 дней; для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °С до анализа. Перед анализом образцы измельчают.

10. Проведение определения

10.1. Экстракция имидаклоприда

Навеску измельченного растительного материала массой 25 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 см³, добавляют 125 см³ смеси ацетон-вода с объемным соотношением компонентов 3:1 и гомогенизируют 3 мин при 10000 об./мин. Гомогенат фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена. Осадок на фильтре промывают 50 см³ приведенной выше смеси. Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в мерный цилиндр, измеряют объем раствора и 1/5 его часть, эквивалентную 5 г образца, переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 10.2.

10.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Аликвоту экстракта пробы (п. 10.1) упаривают до водного остатка (около 5 - 7 см³) на роторном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С. Водный остаток в колбе переносят в делительную воронку вместимостью 100 см³, добавляют 30 см³ бидистиллированной воды и 30 см³ хлористого метилена, предварительно обмыв ими колбу, в которой находилась проба, интенсивно встряхивают в течение 1 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой собирают в делительную воронку вместимостью 250 см³, а водную фазу экстрагируют еще дважды, используя 30 и 20 см³ хлористого метилена. К объединенной дихлорметановой фракции в делительной воронке вместимостью 250 см³ приливают 20 см³ водного раствора углекислого калия с молярной концентрацией 0,05 моль/дм³ (п. 8.2), содержимое интенсивно встряхивают в течение 1 мин. После разделения фаз нижний органический слой, содержащий имидаклоприд, фильтруют через слой безводного серно-кислого натрия, помещенный на бумажном фильтре в химическую воронку, в круглодонную колбу вместимостью 100 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 10.3.

10.3. Очистка экстракта на колонке с силикагелем

Сухой остаток в колбе, полученный по п. 10.2, количественно переносят тремя порциями по 1 см³ смеси гексан-ацетон в объемном соотношении 7:3 в подготовленную хроматографическую колонку (п. 8.9). Колонку промывают 35 см³ смеси гексан-ацетон (7:3, по объему), которые отбрасывают. Имидаклоприд элюируют с колонки 55 см³ смеси гексан-ацетон с объемным соотношением компонентов 7:3 со скоростью 1 - 2 капли в секунду в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 35 °С. Сухой остаток растворяют в 12,5 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 8.4) и анализируют на содержание имидаклоприда по п. 7.2.

Полнота извлечения имидаклоприда при проведении всех операций подготовки пробы не менее 83 % для образцов репки и зеленой массы лука.

11. Выполнение измерений

11.1. В инжектор хроматографа вводят 5 мм³ очищенного экстракта анализируемой пробы (п. 10.1 - 10.3), анализируют при условиях п. 7.2 и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.

11.2. Для каждого образца репки и зеленой массы повторяют операции по п. 10.1 - 10.3, 11.1.

12. Обработка результатов измерений

12.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используют программу сбора и обработки хроматографической информации.

Альтернативная обработка результатов.

Массовую долю имидаклоприда X, мг/кг в образцах зеленой массы и репки лука рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

(2)

H₁ - площадь пика имидаклоприда в образце, мкВ∙с;

Н₀ - площадь пика имидаклоприда в стандартном растворе, мкВ∙с;

А - концентрация стандартного раствора имидаклоприда, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемой части образца, соответствующая доле экстракта, использованной для очистки на колонке с силикагелем и последующего хроматографического определения, г;

0,83 - коэффициент извлечения имидаклоприда, учитывающий все процедуры подготовки пробы.

12.2. За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

(3)

X₁, X₂ - результаты параллельных определений массовой доли имидаклоприда, мг/кг;

r - значение предела повторяемости, % (табл.).

Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями методики.

12.3. Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:

- среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

±δ - границы относительной погрешности измерений, % (табл.).

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«массовая доля имидаклоприда в пробах репки и зеленой массы лука менее 0,05 мг/кг»*.

________

* - 0,05 мг/кг - предел обнаружения.

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал имидаклоприда, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 0,2 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой и анализируют в соответствии с данной методикой.

13. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

13.1. Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

13.2. Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

13.3. Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

(4)

X₁, Х₂ - результаты измерений массовой доли имдаклоприда, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (%), рассчитываемый по формуле R = 2,8 × σ_R.

Если предел воспроизводимости не превышен, то приемлемы все результаты измерений и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если предел воспроизводимости превышен, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.4).

14. Контроль качества результатов измерений при реализации методики в лаборатории

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 («Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений»), используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

Содержание

1. Назначение и область применения. 1

2. Метрологические характеристики. 2

3. Метод измерений. 4

4. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы.. 4

4.1. Средства измерений. 4

4.2. Реактивы.. 4

4.3. Вспомогательные устройства, материалы.. 4

5. Требования безопасности, охраны окружающей среды.. 5

6. Требования к квалификации операторов. 5

7. Требования к условиям измерений. 5

7.1. Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу. 6