4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
бифеназата и D 3598 в воде, почве,
яблоках и яблочном соке методом
высокоэффективной жидкостной
хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.3100-13

Москва • 2014

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России (В.А. Калинин, Е.В. Довгилевич, А.В. Довгилевич, Н.В. Устименко).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. № 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 8 августа 2013 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств бифеназата и D 3598
в воде, почве, яблоках и яблочном соке методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

Свидетельство о метрологической аттестации от 4.10.2012 № 01.00282-2008/0133.04.10.12.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовых концентраций бифеназата и D 3598 в воде в диапазоне 0,005 - 0,05 мг/дм³ и в почве в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг, а также уровня их остаточных количеств в яблоках и яблочном соке в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: бифеназат.

Название действующего вещества по ИЮПАК: Изопропил 3-(4-метоксибифенил-3-ил)карбазат.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₇H₂₀N₂O₃.

Молекулярная масса: 300,4.

Агрегатное состояние: кристаллическое вещество.

Цвет, запах: белый, без запаха.

Давление паров: 1 ∙ 10^-2 мРа (25 °С).

Коэффициент распределения октанол-вода: log K_ow = 3,4 (25 °С, pH 7).

Температура плавления: 123 - 125 °С.

Растворимость в воде (мг/дм³, при 20 °С): 2,06.

Растворимость в органических растворителях (г/дм³, 20 °С): этилацетат - 102; ацетонитрил - 95,6; метанол - 44,7; толуол - 24,0; н-гексан - 0,232.

Бифеназат стабилен не более 1 года при температуре 20 °С и относительной влажности 50 %.

Подвергается гидролизу (при 25 °С): DT₅₀ составляет 9 - 10 дней (pH 4); 5,4 дня (pH 5); 0,8 дня (pH 7), 0,08 дня (pH 9) и фотолизу (25 °С, pH 5): DT₅₀ составляет 17 ч.

Бифеназат - основание с рКа - 12,94 (23 °С).

Основной метаболит бифеназата - D 3598.

N-(4-метоксибифенил-3-ил)диазенкарбоновой кислоты изопропиловый эфир.

Эмпирическая формула: C₁₇H₁₈N₂O₃.

Молекулярная масса: 298,3.

Другие физико-химические свойства D 3598 не представлены.

Краткая токсикологическая характеристика. Бифеназат относится к мало опасным веществам по острой пероральной (ЛД₅₀ для крыс составляет более 5 000 мг/кг) и дермальной (ЛД₅₀ для крыс составляет более 2 000 мг/кг) токсичности, но к умеренно опасным по ингаляционной токсичности (ЛК₅₀ для крыс (4 ч) - более 4 400 мг/м³ воздуха). Вызывает слабое покраснение кожи и глаз у кроликов, раздражает кожу и слизистую оболочку глаз. Не является мутагеном. Не обладает тератогенной активностью для крыс и кроликов, не является канцерогеном для крыс и мышей.

Область применения. Бифеназат - несистемный акарицид с контактным действием и продолжительным последействием, рекомендуется к применению для борьбы с насекомыми на стадии яиц и личинок на плодовых деревьях (яблони, груши, цитрусовые), орехах, овощах, декоративных культурах, хлопке и кукурузе.

В России для бифеназата установлены следующие гигиенические нормативы: ВДСД - 0,01 мг/кг массы человека; ВМДУ для импортной продукции (мг/кг): хлопок (семена) - 0,3; изюм, перец сладкий, плодовые косточковые, клубника - 2,0; овощи со съедобными плодами, тыквенные, томат - 0,5; виноград, плодовые семечковые - 0,7; хмель сухой - 20,0; перец Чили - 3,0; орехи - 0,2; мясо млекопитающих (кроме морских), молочный жир - 0,05; молоко, птица (мясо, субпродукты) - 0,01; мята - 40,0; яйца, субпродукты (млекопитающих) - 0,001; миндаль в шелухе - 10,0.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 и 2 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 3 и 4.

Таблица 1

Метрологические параметры для бифеназата

Таблица 2

Метрологические параметры для D 3598 (в виде бифеназата)

Таблица 3

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для бифеназата

Таблица 4

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для D 3598 (в виде бифеназата)

2. Метод измерений

Метод основан на определении бифеназата и D 3598 с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на концентрирующих патронах № 1 и 2. D 3598 определяют в виде бифеназата после восстановления его аскорбиновой кислотой.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы.

Алонж прямой с отводом для вакуума (АО-14/23) для работы с концентрирующими патронами	ГОСТ 25336-82
Аппарат для встряхивания проб с возвратно-поступательным направлением колебаний, с максимальной загрузкой 10 кг, с амплитудой колебаний 30 мм и скоростью от 10 до 300 колебаний в минуту
Банки полипропиленовые с крышками для экстракции вместимостью 250 см3
Ванна ультразвуковая с потребляемой мощностью 140 Вт, рабочей частотой 50 Гц, рабочим объемом 4,5 дм3
Вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная	ГОСТ 5556-81
Воронки делительные на 250 см3	ГОСТ 25336-82
Воронки лабораторные стеклянные	ГОСТ 25336-82
Испаритель ротационный вакуумный с ручным подъемником, с диагональным конденсором и объемом испарительной колбы от 50 до 3 000 см3, с изменяемой скоростью вращения штока испарителя от 5 до 240 об./мин, с водяной баней с антикоррозионным покрытием объемом 5 дм3 и с диапазоном температур от 20 до 100 °С
Колбы конические плоскодонные на 100, 250 и 1 000 м3	ГОСТ 25336-82
Колбы круглодонные со шлифом (концентраторы) на 100, 250 см3 и 4000 см3 ТС	ТУ 92-891.029-91
Колонка хроматографическая стальная, длиной 250 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С18
Насос диафрагменный, химически стойкий на 100 %, с мощностью электропривода 245 Вт, предельным вакуумом 100 мбар/абс., с избыточным давлением 1 бар и скоростью откачки 34 дм3/мин
Предколонка хроматографическая стальная, длиной 20,0 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С8
Сито лабораторное с полотном из латуни или нержавеющей стали с размером ячеек 1 мм	ГОСТ 3826-82 и ГОСТ 6613-86
Стаканы стеклянные, термостойкие, объемом 50 - 500 см3	ГОСТ 25336-82
Установка для перегонки растворителей с круглодонной колбой объемом 4 000 см3 и приемной конической колбой объемом 1 000 см3
Фильтры обеззоленные нейтральные, быстро фильтрующие, диаметром 11 см, зольность одного фильтра 0,00072 г	ТУ-6-09-1678-86
Фильтры для очистки растворителей, диаметром 20 мм, с отверстиями пор 20 мкм
Центрифуга MPW-350e с числом оборотов 4 000 об./мин и с набором полипропиленовых банок емкостью 200 см3
Шприц инъекционный многократного применения объемом 10 см3	ГОСТ 22967-90

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.1.004-91.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С, относительной влажности не более 80 % и нормальном атмосферном давлении;

• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению определений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов № 1 и 2 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на концентрирующих патронах № 1 и 2, установление градуировочной характеристики.

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в крутодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °С, отбрасывают.

7.1.2. Приготовление бидистиллированной воды

Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцово-кислый калий из расчета 1 г/дм³ и кипятят в течение 6 ч.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °С, отбрасывают.

7.2. Приготовление растворов для проведения анализа

7.2.1. Приготовление рабочих растворов

7.2.1.1. Приготовление 1 %-го раствора полиэтиленгликоля.

Мерной пипеткой отбирают 1 см³ полиэтиленгликоля и переносят в мерную колбу на 100 см³, добавляют 50 см³ ацетонитрила. Раствор перемешивают и доводят ацетонитрилом объем в колбе до метки.

7.2.1.2. Приготовление 2 %-го раствора сульфата натрия.

В мерную колбу на 1 000 см³ переносят 20 г безводного сульфата натрия, добавляют 200 - 300 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки.

7.2.1.3. Приготовление 10 %-го раствора аскорбиновой кислоты.

В мерную колбу объемом 10 см³ помещают 5 см³ дистиллированной воды, прибавляют 1 г аскорбиновой кислоты, перемешивают до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки. Раствор готовят непосредственно перед применением.

7.2.2. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил, очищенную воду и ледяную уксусную кислоту.

В плоскодонную колбу объемом 1 000 см³ помещают 600 см³ ацетонитрила, 400 см³ очищенной воды и 5 см³ ледяной уксусной кислоты. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 см³/мин в течение 5 мин, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.

7.2.3. Приготовление смеси для растворения проб

В плоскодонную колбу объемом 100 см³ помещают 0,1 г аскорбиновой кислоты и 100 см³ подвижной фазы. Смесь тщательно перемешивают. Хранят в холодильнике не более 7 суток и используют для растворения проб и приготовления градуировочных растворов.

7.2.4. Приготовление градуировочных растворов

7.2.4.1. Приготовление градуировочных растворов бифеназата.

7.2.4.1.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией бифеназата 100,0 мкг/см³. Взвешивают 10 мг бифеназата в мерной колбе объемом 100 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 1 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 1 хранится в холодильнике не более 14 дней.

7.2.4.1.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией бифеназата 10,0 мкг/см³. Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 50 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 2 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 2 хранится в холодильнике не более 14 дней.

7.2.4.1.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией бифеназата 1,0 мкг/см³. Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 50 см³ и доводят объем до метки смесью для растворения проб (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 3 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 3 хранится в холодильнике не более 7 дней.

7.2.4.1.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией бифеназата 0,5 мкг/см³. Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 5 см³. помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью для растворения проб (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 4 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 7 дней.

7.2.4.1.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией бифеназата 0,2 мкг/см³. Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 2 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью для растворения проб (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 5 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 7 дней.

7.2.4.1.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией бифеназата 0,1 мкг/см³. Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью для растворения проб (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 6 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 7 дней.

7.2.4.1.7. Стандартные растворы бифеназата с концентрацией 2,0; 1,0; 0,4 и 0,2 мкг/см³ для внесения в контрольные образцы. Методом последовательного разведения ацетонитрилом стандартного раствора № 2 готовят растворы, содержащие по 2,0; 1,0; 0,4 и 0,2 мкг/см³ и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы. Стандартные растворы в ацетонитриле хранят не более 1 месяца.

7.2.4.2. Приготовление градуировочных растворов D 3598.

Определяют D 3598 после восстановления его до бифеназата аскорбиновой кислотой.

7.2.4.2.1. Стандартный раствор № 7 с концентрацией D 3598 100,0 мкг/см³. Взвешивают 10 мг D3598 в мерной колбе объемом 100 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 7 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 7 хранится в холодильнике не более 14 дней.

7.2.4.2.2. Стандартный раствор № 8 с концентрацией D 3598 10,0 мкг/см³. Из стандартного раствора № 7 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 50 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 7 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 7 хранится в холодильнике не более 14 дней.

7.2.4.2.3. Стандартный раствор № 9 с концентрацией D 3598 1,0 мкг/см³. Из стандартного раствора № 8 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 50 см³ и доводят объем до метки смесью для растворения проб (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 9 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 9 хранится в холодильнике не более 7 дней.

Стандартный раствор № 9 после приготовления выдерживают при комнатной температуре не менее 3 ч и по истечении этого времени используют его для приготовления градуировочных стандартов № 10, 11 и 12.

7.2.4.2.4 Стандартный раствор № 10 с концентрацией D 3598 0,5 мкг/см³. Из стандартного раствора № 9 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью для растворения проб (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 10 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 7 дней.

7.2.4.2.5. Стандартный раствор № 11 с концентрацией D 3598 0,2 мкг/см³. Из стандартного раствора № 9 отбирают пипеткой 2 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью для растворения проб (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 11 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 7 дней.

7.2.4.2.6. Стандартный раствор № 12 с концентрацией D 3598 0,1 мкг/см³. Из стандартного раствора № 9 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью для растворения проб (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 12 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 7 дней.

7.2.4.2.7. Стандартные растворы D 3598 с концентрацией 2,0; 1,0; 0,4 и 0,2 мкг/см³ для внесения в контрольные образцы. Методом последовательного разведения ацетонитрилом стандартного раствора № 8 готовят растворы, содержащие по 2,0; 1,0; 0,4 и 0,2 мкг/см³ и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы. Стандартные растворы в ацетонитриле хранят не более 1 месяца.

7.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации бифеназата и D 3598 (в виде бифеназата) в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см³.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

7.4. Подготовка концентрирующего патрона № 2 для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения бифеназата на нем

7.4.1. Подготовка концентрирующего патрона № 2 для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин (1 - 2 кап./с).

Патрон № 2 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц объемом не менее 10 см³ (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1. Элюат отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.4.2. Проверка хроматографического поведения бифеназата на концентрирующем патроне № 2

Из стандартного раствора бифеназата в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/см³, отбирают 1 см³, помещают в концентратор объемом 100 см³, прибавляют 1 см³ 1 %-го раствора полиэтиленгликоля и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 см³ ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 8 см³ гексана, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см³, прибавляют 1 см³ 1 %-го раствора полиэтиленгликоля, упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Исходный концентратор обмывают последовательно двумя порциями по 10 см³ каждая смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 см³, прибавляют 1 см³ 1 %-го раствора полиэтиленгликоля, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие бифеназат, полноту смывания с патрона и необходимый объём элюента.

Изучение поведения бифеназата на концентрирующих патронах № 2 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.

7.5. Подготовка концентрирующего патрона № 1 для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения бифеназата на нем

7.5.1. Подготовка концентрирующего патрона № I для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин (1 - 2 кап./с).

Патрон № 1 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц объемом не менее 10 см³ (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 9:1. Элюат отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.5.2. Проверка хроматографического поведения бифеназата па концентрирующем патроне № 1

Из стандартного раствора бифеназата в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/см³, отбирают 1 см³, помещают в концентратор объемом 100 см³, прибавляют 1 см³ 1 %-го раствора полиэтиленгликоля и упаривают па ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 см³ воды, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, прибавляют 1 см³ 1 %-го раствора полиэтиленгликоля, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Исходный концентратор обмывают последовательно 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:4, 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:2 и 15 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом 100 см³, прибавляют в каждый концентратор по 1 см³ 1 %-го раствора полиэтиленгликоля, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие бифеназат, полноту смывания с патрона и необходимый объём элюента.

Изучение поведения бифеназата на концентрирующих патронах № 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.

7.6. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии

Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °С и скорости потока подвижной фазы 1 см³/мин 3 - 4 ч.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», № 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ Р 51592 -2000 «Вода. Общие требования к отбору проб», ГОСТ 17.4.3.01-83 «Почвы. Общие требования к отбору проб», ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб», ГОСТ 27572-87 «Яблоки свежие для промышленной переработки. Технические условия», ГОСТ Р 52184-2003 «Соки плодовые и ягодные натуральные».

Пробы воды хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °С не более 10 суток.

Для длительного хранения проб почвы, почву подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в темной таре в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Пробы яблок хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре от 0 до 4 °С не более суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °С до 2 лет. Перед анализом яблоки размораживают и измельчают на терке.

Пробы яблочного сока хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °С не более 5 суток.

9. Выполнение определения

9.1. Вода

9.1.1. Экстракция

Пробу воды объемом 100 см³ помещают в делительную воронку объемом 250 см³, прибавляют 5 г хлористого натрия, 1 см³ свежеприготовленного 10 %-го водного раствора аскорбиновой кислоты и перемешивают до полного растворения соли. Бифеназат и D 3598 экстрагируют тремя порциями диэтилового эфира объемом по 30 см³, встряхивая каждый раз делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (диэтиловый эфир) собирают в концентраторе объемом 250 см³, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, прибавляют 1 см³ 1 %-го раствора полиэтиленгликоля и объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 5 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Для определения D 3598: сухой остаток растворяют в 5 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3), выдерживают 3 ч при комнатной температуре для прохождения реакции восстановления D 3598 до бифеназата аскорбиновой кислотой, затем 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.2. Почва

9.2.1. Экстракция и очистка полученного экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Пробу почвы весом 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции и центрифугирования объемом 200 см³, прибавляют 10 см³ 2 %-го раствора сульфата натрия, 1 см³ свежеприготовленного 10 %-го водного раствора аскорбиновой кислоты, 75 см³ ацетонитрила, помещают на 5 мин в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин на аппарат для встряхивания проб. Затем пробу центрифугируют в течение 4 мин на скорости 4 000 об./мин. Супернатант фильтруют через фильтр средней плотности в коническую колбу объемом 250 см³ с 10 г сухого хлористого натрия. Экстракцию повторяют еще один раз, используя 75 см³ ацетонитрила и помещая на 5 мин в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин на аппарат для встряхивания проб. Пробы центрифугируют, фильтруют, экстракты объединяют в конической колбе объемом 250 см³ с 10 г сухого хлористого натрия, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 10 мин.

Объединенный экстракт из колбы переносят в делительную воронку объемом 250 см³ (не растворившуюся соль оставляют в колбе), оставляют до полного разделения слоев и нижний (водный) слой отбрасывают.

К ацетонитрильному экстракту в делительной воронке прибавляют 50 см³ гексана и интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз отбрасывают выделившийся нижний водный слой, ацетонитрильный экстракт собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 см³, осушитель обмывают 10 см³ ацетонитрила, смыв объединяют с основным экстрактом, прибавляют 2 см³ 1 %-го раствора полиэтиленгликоля и объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Верхний гексановый слой отбрасывают.

9.2.2. Очистка экстракта перераспредепением в системе несмешивающихся растворителей

Для определения бифеназата: к остатку в концентраторе, полученному по п. 9.2.1, прибавляют 3 см³ ацетонитрила, обмывают стенки колбы, прибавляют туда же 50 см³ 2 %-го раствора сульфата натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 см³.

Для определения D 3598 (либо суммарного содержания бифеназата и D 3598): к остатку в концентраторе, полученному по п. 9.2.1, прибавляют 5 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и оставляют при комнатной температуре на 3 ч для прохождения реакции восстановления D 3598 до бифеназата аскорбиновой кислотой. После прохождения реакции в концентратор прибавляют 50 см³ 2 %-го раствора сульфата натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 см³.

Бифеназат экстрагируют тремя порциями диэтилового эфира объемом по 20 см³, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (диэтиловый эфир) собирают в концентратор объемом 250 см³ через слой безводного сульфата натрия, прибавляют 1 см³ 1 %-го раствора полиэтиленгликоля и объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.2.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 2

Сухой остаток, полученный по п. 9.2.2, растворяют в 2 см³ ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 8 см³ гексана, перемешивают и вносят на подготовленный патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см³. Исходный концентратор обмывают 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1, вносят на патрон, элюат объединяют, прибавляют 1 см³ 1 %-го раствора полиэтиленгликоля и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.2.4. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1

Сухой остаток, полученный по п. 9.2.3, растворяют в 1 см³ ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 см³ воды, перемешивают и вносят на подготовленный патрон. Элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают последовательно 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:4 и 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:2, элюаты отбрасывают. Бифеназат элюируют с патрона 15 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. К элюату прибавляют 1 см³ 1 %-го раствора полиэтиленгликоля, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.3. Плоды яблок

9.3.1. Экстракция

Образец измельченных яблок массой 20 г помешают в полипропиленовую банку для экстракции и центрифугирования объемом 250 см³, прибавляют 100 см" ацетонитрила и помещают на 5 мин в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин на аппарат для встряхивания проб. Ацетонитрильный экстракт фильтруют в плоскодонную колбу объемом 250 см³ с 10 г сухого хлористого натрия, прибавляют туда 1 см³ свежеприготовленного 10 %-го водного раствора аскорбиновой кислоты и выдерживают при комнатной температуре 10 мин. Экстракт из колбы переносят в делительную воронку объемом 250 см³ (не растворившуюся соль оставляют в колбе), оставляют до полного разделения слоев и нижний (водный) слой отбрасывают.

К ацетонитрильному экстракту в делительной воронке прибавляют 50 см³ гексана и интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз отбрасывают выделившийся нижний водный слой. Ацетонитрильный экстракт собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 см³, осушитель обмывают 10 см³ ацетонитрила, смыв объединяют с основным экстрактом, прибавляют 2 см³ 1 %-го раствора полиэтиленгликоля и объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Верхний гексановый слой отбрасывают.

Далее проводят очистку экстракта как указано в п. 9.2.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и п. 9.2.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 2.

Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.4. Яблочный сок

9.4.1. Экстракция

Образец яблочного сока массой 20 г помещают в делительную воронку объемом 250 см³, прибавляют туда 20 см³ 2 %-го раствора сульфата натрия, 1 см³ свежеприготовленного 10 %-го водного раствора аскорбиновой кислоты, 100 см³ ацетонитрила и интенсивно встряхивают воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой отбрасывают, ацетонитрильный экстракт переносят в плоскодонную колбу объемом 250 см³ с 10 г сухого хлористого натрия и выдерживают при комнатной температуре 10 мин. Экстракт из колбы переносят в делительную воронку объемом 250 см³ (не растворившуюся соль оставляют в колбе), оставляют до полного разделения слоев и нижний (водный) слой отбрасывают.

К ацетонитрильному экстракту в делительной воронке прибавляют 50 см³ гексана и интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз отбрасывают выделившийся нижний водный слой. Ацетонитрильный экстракт собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 см³, осушитель обмывают 10 см³ ацетонитрила, смыв объединяют с основным экстрактом, прибавляют 2 см³ 1 %-го раствора полиэтиленгликоля и объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 “С. Верхний гексановый слой отбрасывают.

Далее проводят очистку экстракта как указано в п. 9.2.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и п. 9.2.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 2.

Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.5. Условия хроматографирования

Хроматографическая система, включающая:

- хроматограф жидкостный, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °С, с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкал;

- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.

Колонка хроматографическая стальная, длиной 250 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С18.

Предколонка хроматографическая стальная, длиной 20,0 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С8.

Температура колонки: 30 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода - ледяная уксусная кислота в соотношении 600:400:5.

Длина волны: 270 нм.

Объем вводимой пробы 20 мм³.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

10. Обработка результатов

Содержание бифеназата или D 3598 (в виде бифеназата) рассчитывают по формуле:

X - содержание бифеназата или D 3598 в пробе, мг/кг или мг/дм³;

S_ст - высота (площадь) пика стандарта, мм;

S_пр - высота (площадь) пика образца, мм;

A - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г (см³);

Р - содержание бифеназата или D 3598 в аналитическом стандарте, %.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 ∙ σ_r.

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

∆ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг»^*.

_____________

^* - 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Контроль стабильности градуировочной характеристики для бифеназата или D 3598 проводят при смене основных градуировочных растворов № 1, 2, 7 и 8 каждые 14 суток, при смене основных градуировочных растворов № 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11 и 12 - каждые 7 суток, а также в начале и при окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание бифеназата или D 3598 в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация бифеназата или D 3598 контрольного измерения, мкг/см³;

С - известная концентрация градуировочного раствора бифеназата или D 3598 в смеси для растворения проб (п. 7.2.3), взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

2,24 или 3,29 - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (А) превышает 2,24 % (или 3,29 %), делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов бифеназата или D 3598, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 7.3.

13.2. Плановый внутршабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

(±; ±) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

∆ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

 - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Приложение 1

Полнота извлечения бифеназата из воды, почвы, яблок и яблочного сока
(5 повторностей для каждой концентрации, Р = 0,95)

Приложение 1

Полнота извлечения D 3598 из воды, почвы, яблок и яблочного сока
(5 повторностей для каждой концентрации, Р = 0,95)

Содержание