Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Обнаружение, идентификация и
количественное определение охратоксина А
в продовольственном сырье и пищевых
продуктах методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Методические указания

МУК 4.1.2204-07

Москва 2007

1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (академик РАМН, профессор В.А. Тутельян, д.х.н. К.И. Эллер, к.м.н. И.В. Аксёнов).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 20 мая 2007 г. и введены в действие с 1 августа 2007 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Обнаружение, идентификация и
количественное определение охратоксина А
в продовольственном сырье и пищевых продуктах
методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Методические указания

1. Назначение и область применения

Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) определения охратоксина А в продовольственном сырье и пищевых продуктах и предназначены для проведения лабораторных исследований учреждениями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, в организациях, осуществляющих контроль безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов.

2. Общие положения

Охратоксин А - микотоксин, продуцируемый микроскопическими грибами родов Aspergillus и Penicillium. Основными продуцентами охратоксина А являются A. ochraceus и P. verrucosum.

Охратоксин A (C₂₀H₁₈ClNO₆; молекулярная масса 403,8), представляющий собой по химической структуре 5-хлоризокумарин, связанный пептидной связью с L-фенилаланином, хорошо растворим в полярных органических растворителях и водном растворе гидрокарбоната натрия, малорастворим в воде. При фотометрировании раствора охратоксина А в толуол-уксусной кислоте (99:1) максимум поглощения наблюдается при длине волны, равной 333 нм, при этом относительный молярный коэффициент поглощения равен 544 м²/моль.

В экспериментах in vivo показано нефротоксическое, канцерогенное, тератогенное, эмбриотоксическое, нейротоксическое и иммунотоксическое действие охратоксина А. Международное агентство по изучению рака классифицирует охратоксин А как соединение, потенциально канцерогенное для человека (Группа 2В). Комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам и контаминантам установлена величина условно переносимого недельного поступления охратоксина А с пищей - 100 нг/кг массы тела.

Охратоксин А выявляется повсеместно в качестве природного загрязнителя продовольственного и кормового зерна, кофе и какао-бобов, винограда и специй.

3. Принцип метода

Метод включает следующие этапы:

• экстракция охратоксина А из пробы смесью ацетонитрил-вода (60:40 % об.);

• очистка экстракта на иммуноаффинной колонке;

• определение охратоксина А с помощью ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием при длине волны возбуждения (l_возб.) 333 нм и длине волны эмиссии (l_эмис) 466 нм.

Диапазон определяемых концентраций: 0,0001 - 0,016 мг/кг.

Предел количественного определения: 0,0005 мг/кг.

Таблица

Метрологические характеристики метода, установленные для разных концентраций охратоксина А в пробе

4. Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, реактивы и материалы

4.1. Средства измерений

4.2. Вспомогательное оборудование

4.3. Реактивы и материалы

5. Подготовка к выполнению измерений

5.1. Приготовление стандартных растворов охратоксина А

Для приготовления стандартного раствора хранения (концентрация охратоксина А - 10 нг/мкл) навеску кристаллического охратоксина А массой 5 мг помещают в мерную колбу объемом 500 см³, приливают 50 см³ смеси толуол-уксусная кислота (98:2 % об.), тщательно перемешивают до полного растворения вещества и доводят той же смесью растворителей до метки. Для установления точной концентрации раствора хранения измеряют его оптическую плотность при длине волны 333 нм (Д₃₃₃). Концентрацию раствора вычисляют по формуле:

Далее 5 см³ стандартного раствора охратоксина А с концентрацией 10 нг/мкл разбавляют смесью толуол-уксусная кислота (98: 2 % об.) до объема 100 см³, получая рабочий раствор с концентрацией 0,5 нг/мкл.

Для приготовления рабочих растворов охратоксина А с концентрацией 0,005; 0,05 и 0,1 нг/мкл отбирают соответственно 50, 500 и 1000 мкл раствора с концентрацией 0,5 нг/мкл, упаривают досуха и растворяют в 5 см³ подвижной фазы.

Раствор хранения охратоксина А содержат в стеклянной посуде с притертой пробкой в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) до одного года и используют для приготовления рабочих стандартных растворов. Рабочие стандартные растворы хранят в вайлах из темного стекла в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) в течение 1 месяца.

Перед использованием рабочих стандартных растворов их следует довести до комнатной температуры и только после этого следует открывать пробки.

5.2. Приготовление фосфатного буферного раствора, рН = 7,4

Навеску натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного массой 1,15 г, навеску натрия однозамещенного 2-водного массой 0,124 г и навеску натрия хлорида массой 1,74 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 10 - 20 см³ дистиллированной воды. Перемешивают и доводят объем раствора в колбе до метки. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.

5.3. Приготовление смесей растворителей

Толуол-уксусная кислота (98:2 % об.).

В мерную колбу на 1000 см³ вносят 20 см³ уксусной кислоты и, перемешивая, доводят толуолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрил-вода (60:40 % об.).

В мерную колбу на 1000 см³ вносят 600 см³ ацетонитрила и, перемешивая, доводят водой до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрил-вода (60:40 % об.; рН = 3,0).

В мерную колбу на 1000 см³ вносят 600 см³ ацетонитрила и, перемешивая, доводят бидистиллированной водой до метки. Внесением фосфорной кислоты подводят рН смеси до величины, равной 3,0. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Метанол-уксусная кислота (98:2 % об.).

В мерную колбу на 1000 см³ вносят 20 см³ уксусной кислоты и, перемешивая, доводят метанолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

6. Отбор и подготовка проб для анализа

6.1. Отбор проб

Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией:

• «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб» ГОСТ 13586.3-83;

• «Крупа. Правила приемки и методы отбора проб» ГОСТ 26312.1-84;

• «Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб» ГОСТ 27668-88;

• «Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию» ГОСТ 8756.0-70.

Пробы для анализа, представительные по концентрации микотоксинов для всей партии, следует отбирать из предварительно гомогенизированного среднего (исходного) образца массой 2 кг.

6.2. Подготовка проб для анализа

Отобранные пробы измельчают в течение 1 - 2 мин в лабораторной мельнице. При этом используют две параллельные пробы.

6.2.1. Экстракция

Навеску 25 г измельченной пробы помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 см, добавляют 100 см³ смеси ацетонитрил-вода (60:40 % об.). Экстрагируют на аппарате для встряхивания проб в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр «синяя лента». Отбирают 10 см³ фильтрата и добавляют 90 см фосфатного буферного раствора, рН = 7,4.

6.2.2. Очистка экстракта

На иммуноаффинную колонку наносят 100 мл полученной смеси со скоростью 1 - 2 капли в секунду, промывают 20 см³ фосфатного буферного раствора, рН = 7,4. Охратоксин А элюируют 3 см³ смеси метанол-уксусная кислота (98: 2 % об.).

7. Выполнение измерений

7.1. Приготовление тестового образца

Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 400 мкл подвижной фазы (раствор А).

7.2. Условия хроматографирования

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза - ацетонитрил-вода (60:40 % об.; рН = 3,0); скорость подвижной фазы - 1,5 см³/мин.

Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 333 нм, на линии эмиссии устанавливают эмиссионный фильтр с полосой пропускания 466 нм.

Для анализа проб в инжектор хроматографа вводят с помощью микрошприца 50 мкл тестового образца (раствора А). При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с охратоксином А, рассчитывают массу охратоксина А во вколе с помощью градуировочного графика.

8. Обработка результатов измерения

8.1. Построение градуированной зависимости

Для построения градуировочного графика проводят хроматографический анализ серии рабочих растворов стандартов. В инжектор с помощью микрошприца вводят 50 мкл рабочего раствора стандарта с концентрацией 0,005 нг/мкл, что соответствует 0,25 нг охратоксина А. Подобное делается для других стандартных растворов с концентрациями 0,05 и 0,10 нг/мкл, что в свою очередь соответствует 2,5 и 5,0 нг охратоксина А во вколе. В указанных условиях время удерживания находится для охратоксина А в диапазоне от 4 до 5 мин. На основании полученных данных строят градуировочный график (зависимость площади хроматографического пика от массы охратоксина А во вколе).

8.2. Оформление результатов

Расчет концентрации охратоксина А в пробе проводится по формуле:

С_{(охр. А)} - концентрация охратоксина А в пробе, мг/кг;

М - масса навески для анализа, г (25,0);

т - масса охратоксина А, соответствующая введенному в хроматограф объему раствора А, нг;

V₁ - объём раствора для экстракции, см³ (100);

V₂ - объём экстракта, нанесенный на ПАК, см³ (10);

V₃ - общий объём раствора А, см³ (0,4);

V₄ - объём раствора А, введенный в хроматограф, см³ (0,05).

При высоких уровнях загрязнения охратоксином А пробы необходимо увеличить объем раствора A (V₃) с внесением соответствующих изменений в формулу.

За окончательный результат испытаний принимается среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений:

Результат анализа представляют в виде (при вероятности Р = 0,95):

D - граница абсолютной погрешности:

d - граница относительной погрешности методики (показатель точности), % (табл. 1).

Если содержание охратоксина А в пробе менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание охратоксина А в пробе зерна менее 0,0001 мг/кг»^*

______________

^* 0,0001 мг/кг - предел обнаружения.

8.3. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

Допустимое расхождение между параллельными измерениями (R) определяют на основании предела повторяемости (r) (табл. 1):

R = 0,01 (r, %)×, мг/кг

Если расхождение между параллельными определениями не превышает допустимого:

то среднее арифметическое принимают за результат анализа.

При превышении норматива R следует повторить измерения, используя резервные пробы.

9. Контроль качества результатов измерений

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами контроля являются рабочие пробы продовольственного сырья и пищевых продуктов. Отбирают пробу и разделяют ее на 2 равные части. Одну из них оставляют без изменений, а к другой добавляют такое количество раствора стандарта охратоксина А, чтобы его массовая доля в пробе по сравнению с исходным значением увеличилась на 50 - 100 %. Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.

Обе пробы анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результаты анализа исходной пробы (С_(отр.А)) и пробы с добавкой (С¢_(отр.А)). Определение проводят в одинаковых условиях, а именно: анализ проводит один аналитик, с использованием одного набора мерной посуды, реактивов, растворов и т, д.

Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольного определения, равного разности между результатом контрольного измерения пробы с добавкой (С¢_(охр.А)), пробы без добавки (С_(охр.А)) и величиной добавки (С_{доб(охр.А)}) с нормативом оперативного контроля (K). Решение об удовлетворительной погрешности принимается при выполнении следующего условия (при Р = 0,95):

Норматив оперативного контроля погрешности рассчитывают по формуле (Р = 0,90):

K = 0,84×(D²С¢_(охр.А) + D²С_(охр.А))^1/2

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют с использованием другой пробы.

10. Требования техники безопасности

При выполнении анализов необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.2.007.0 и ГОСТ 4658. Помещение лаборатории должно соответствовать санитарным правилам проектирования, оборудования, эксплуатации и содержания производственных и лабораторных помещений, предназначенных для проведения работ с органическими растворителями. Аналитическая лаборатория должна быть оснащена вентиляционными системами по ГОСТ 12.4.021.

11. Требования к квалификации исполнителя

К выполнению анализа охратоксина А в зерне и зернопродуктах допускаются лица со специальным высшим образованием или средним специальным образованием, владеющие техникой ВЭЖХ-анализа, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие опыт работы в химической лаборатории.

12. Условия выполнения измерений

Температура окружающего воздуха от 15 до 25 °С.

Относительная влажность воздуха не более 80 % при 25 °С.

Атмосферное давление 730 - 760 мм рт.ст.

Напряжение электропитания: 210 - 220 В. Частота переменного тока: 45 - 50 Гц.