4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
пестицидов в пищевых продуктах,
сельскохозяйственном сырье и объектах
окружающей среды

Сборник

МУК 4.1.2859 - 4.1.2866-11

Москва 2011

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России (В.А. Калинин, профессор, канд. с-х. наук., Е.В. Довгилевич, ст.н.сотр., канд. биол. наук, А.В. Довгилевич, ст.н.сотр., канд. хим. наук, Н.В. Устименко, ст.н.сотр., канд. биол. наук, Е.Н. Щербинкина, инженер).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 28 12.2010 № 3).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31 марта 2011 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методика измерений остаточных количеств
Тиабендазола в семенах и масле рапса методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания

Общие положения и область применения

Свидетельство об аттестации методики от 23.11.2010 № 01.5.04.693.

Настоящие методические указания устанавливают метод измерения массовой концентрации Тиабендазола в семенах и масле рапса в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг.

1. Краткая характеристика препарата

Действующее вещество: Тиабендазол.

Структурная формула:

Название действующего вещества по ИЮПАК: 2-(1,3-тиазол-4-ил) бензимидазол.

2-(4-тиазолил)-1Н-бензимидазол (С.А.).

Эмпирическая формула: C₁₀H₇N₃S.

Молекулярная масса: 201,3.

Белое кристаллическое вещество. Температура плавления: 297 - 298 °С. Давление паров при 25 °С: 4,6×10^-4 мПа. Коэффициент распределения н-октанол-вода: K_ow logР = 2,39 (рН 7).

Растворимость (г/л) при 20 °С: н-гептан - < 0,01, ксилол - 0,13, ацетон - 2,43, 1,2-дихлорэтан - 0,81, метанол - 8,28, этилацетат - 1,49, н-октанол - 3,91, вода - 10,0 (рН 2), 0,16 (рН 4), 0,03 (рН 7 - 10). Устойчив к гидролизу. Водный фотолиз (20 °С, рН 5, DT₅₀ 29 ч); pКa₁ = 4,73; рКа₂ = 12,00.

Краткая токсикологическая характеристика: Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для мышей - 3600 мг/кг, крыс - 3100 мг/кг, кроликов - 3800 мг/кг, птиц - более 2250 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для кроликов - более 2000 мг/кг, не ирритант; ингаляционная токсичность (LС₅₀) для крыс - более 0,5 мг/кг. Не токсичен для пчел. СК₅₀ для рыб 0,55 мг/л при экспозиции 96 ч. Класс токсичности по ВОЗ-III.

Область применения: Тиабендазол - системный фунгицид защитного и лечебного действия. Тиабендазол образует защитный слой на обработанной поверхности, используется на овощных, плодовых и зерновых культурах. Не совместим с купратами и окисляющими агентами, такими как хлораты и нитраты.

Гигиенические нормативы для Тиабендазола в семенах и масле рапса в России не установлены.

2. Методика определения Тиабендазола в семенах и масле рапса методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении Тиабендазола методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов органическим растворителем с последующей очисткой на колонке с силикагелем.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

2.1.3. Избирательность метода

Избирательность метода определения Тиабендазола достигается сочетанием условий подготовки проб и хроматографического анализа.

2.2. Реактивы и материалы

Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.

2.3. Приборы и посуда

Допускается использование приборов и посуды с метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2.4. Отбор проб

Отбор проб семян рапса производится в соответствии с ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб». Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Растительное масло хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в герметично закрытой стеклянной таре в течение 2 месяцев.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Перед началом работы проверяют чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 см³ растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С до объема 1,0 см³ и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Spherisorb Phenyl) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 см³/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 ч.

2.5.3. Приготовление растворов

Для приготовления 0,005 М раствора ортофосфорной кислоты 0,5 г 98 % ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50 по объему, используя мерные цилиндры.

Для приготовления элюента № 1 в колбе на 1000 мл смешивают 800 мл н-гексана и 200 мл ацетона. Для приготовления элюента № 2 в колбе на 1000 мл смешивают 150 мл н-гексана и 850 мл ацетона.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску Тиабендазола (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/см³).

Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 и 2,0 мгк/cм³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы [смесь ацетонитрил - 0,005 М Н₃РО₄ (40:60, по объему)]. Стандартный и градуировочные растворы можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца.

Для внесения в контрольный образец при определении полноты извлечения используют стандартный раствор, разбавленный ацетонитрилом до нужного уровня концентраций методом последовательного разбавления. Растворы для внесения в масло готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/см³ методом последовательного разбавления по объему изопропиловым спиртом.

2.5.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация Тиабендазола в растворе) в хроматограф вводят по 20 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации Тиабендазола в градуировочном растворе (мкг/см³).

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента:

λ_контр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, %. (λ_контр. = 10 % при Р = 0,95).

2.5.5. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 30 см³ смеси гексан-ацетон (80:20, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 30 см³ элюента № 2 и 30 см³ элюента № 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.6. Проверка хроматографического поведения Тиабендазола на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 0,1 см³ стандартного раствора Тиабендазола с концентрацией 10 мкг/см³. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40 °С), остаток растворяют в 5 см³ элюента № 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 см³ элюента № 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 50 см³ элюента № 1, которые отбрасывают, затем 100 см³ элюента № 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 см³ каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание Тиабендазола (п. 2.6.3).

Фракции, содержащие Тиабендазол, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют (п. 2.6.3). Рассчитывают содержание Тиабендазола в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: параметры удерживания Тиабендазола и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.5.7. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

2.6. Проведение определения

2.6.1. Извлечение Тиабендазола из проб семян и масла рапса

Навеску измельченных семян массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 100 мл и экстрагируют Тиабендазол 40 см³ ацетонитрила на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр «красная лента». Экстракцию повторяют дважды порциями по 30 см³.

Навеску масла массой 20 г помещают в делительную воронку емкостью 250 см³ и экстрагируют Тиабендазол трижды ацетонитрилом порциями по 30 см³, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин и собирая нижний органический слой.

Объединенные экстракты семян или масла промывают гексаном в делительных воронках дважды по 25 см³, встряхивая смесь каждый раз в течение 1 - 2 мин и собирая нижний органический слой.

После этого экстракты выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстрактов проводят на колонке с силикагелем по п. 2.6.2.

Внимание! Отделение ацетонитрильного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

2.6.2. Очистка на колонке с силикагелем

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.1 экстрактов растительных материалов, количественно переносят двумя порциями смеси гексан-ацетон (80:20, по объему) по 5 см³ каждая в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 50 см³ элюента № 1, который отбрасывают. Тиабендазол элюируют 80 см³ элюента № 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 250 см³. Раствор упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 мм³ раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.3. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы «Waters» с УФ-детектором (Waters 2 487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Колонка Spherisorb Phenyl (150×4,6) мм, 3 мкм (Waters, USA).

Температура колонки 30 ± 1 °С.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: ацетонитрил: 0,005 М раствор Н₃РО₄ (40:60, по объему).

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Рабочая длина волны 300 нм.

Объем вводимой пробы 20 мм³.

Линейный диапазон детектирования 0,1 - 2,00 мкг/мл.

2.6.4. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание Тиабендазола в образцах семян или масла (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S₁ - площадь пика Тиабендазола в стандартном растворе, мм² (мв∙сек);

S₂ - площадь пика Тиабендазола в анализируемой пробе, мм² (мв∙сек);

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г;

С - концентрация стандартного раствора Тиабендазола, мкг/см³;

Содержание остаточных количеств Тиабендазола в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2 параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор Тиабендазола 2 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

3. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает придела повторяемости (1):

X₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (r = 2,8σ_r).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

4. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(X ± Δ) мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

Δ = δ∙X/100, где

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее нижней границы определения» (например: менее 0,01 мг/кг*, где * - 0,01 мг/кг - предел обнаружения Тиабендазола в рапсе).

5. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

5.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

5.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

C_д = Δ_л,Х + Δ_л,Х', где

±Δ_л,Х (±Δ_л,Х') - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

Δ_л = ±0,84Δ, где

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг: где

Δ = δ∙X/100, где

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

К_к = X' - X - C_д, где

X', X, C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

5.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

Х₁, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

6. Требования безопасности

6.1. При работе необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

6.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 1.2.2701-10 и ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны».

7. Требования к квалификации оператора

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 5.

8. Разработчики

Цибульская И.А., Черменская Т.Д., Ковров Н.Г. (ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений Россельхозакадемии, г. Санкт-Петербург).

Методика прошла метрологическую экспертизу (Свидетельство об аттестации № 01.5.04.686) и внесена в Федеральный реестр (ФР. 1.31.2011.09107).