4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
пестицидов в пищевых продуктах,
сельскохозяйственном сырье и объектах
окружающей среды

Сборник
МУК 4.1.2859 - 4.1.2866-11

Москва 2011

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России (В.А. Калинин, профессор, канд. с-х. наук., Е.В. Довгилевич, ст.н.сотр., канд. биол. наук, А.В. Довгилевич, ст.н.сотр., канд. хим. наук, Н.В. Устименко, ст.н.сотр., канд. биол. наук, Е.Н. Щербинкина, инженер).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 28 12.2010 № 3).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31 марта 2011 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств Фенпироксимата
в яблочном соке методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Методические указания

Общие положения и область применения

Свидетельство об аттестации методики от 01.12.2010 № 0062.30.11.10.

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств Фенпироксимата в яблочном соке в диапазоне 0,1 - 1,0 мг/кг.

Структурная формула:

Название действующего вещества по ИЮПАК:

Трет-бутил-(Е)- а-(1,3-диметил-5-феноксипиразол1-4-илметилена-мино-окси)-р-толуат.

Эмпирическая формула: C₂₄H₂₇N₃O₄.

Молекулярная масса: 421,5.

Агрегатное состояние: порошок.

Цвет, запах: белый, без запаха.

Давление паров: 0,0075 мПа (при 25 °С).

Коэффициент распределения октанол-вода: К_ow logP = 5,01 (при 20 °С).

Температура плавления: 101,1 - 102,4 °С.

Растворимость в воде мг/дм³ (20 °С): 1,46×10^-2.

Растворимость в органических растворителях (г/дм³, 25 °С): ацетон - 150; дихлорметан - 1307; метанол - 15; хлороформ - 1197; тетрагидрофуран - 737.

Стабилен в кислой и щелочной средах.

DT₅₀ в почве составляет 26,3 - 49,7 дней.

Краткая токсикологическая характеристика: Фенпироксимат относится к веществам умеренно опасным по острой пероральной (ЛД₅₀ для крыс от 245 до 480 мг/кг), малоопасным по дермальной токсичности (ЛД₅₀ для крыс более 2000 мг/кг), но чрезвычайно опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛK₅₀ для крыс (4 ч) от 330 до 360 мг/м³). Слегка раздражает глаза кроликов, но не вызывает раздражения кожных покровов. В длительном опыте не выявлен канцерогенный, тератогенный и мутагенный эффект.

Область применения: Фенпироксимат - акарицид, который ингибирует митохондриальный транспорт электронов. Действует на стадиях личинок, нимф и взрослых особей. Применяется на посадках цитрусовых, яблок, персиков, груш, винограда в концентрации 25 - 75 г/га.

Проходит регистрационные испытания на яблонях с нормой расхода 0,75 дм³/га.

В России для Фенпироксимата установлены следующие гигиенические нормативы: МДУ в яблочном соке - 0,2 мг/кг.

1. Метрологическая характеристика метода

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 1

Метрологические параметры для Фенпироксимата

Таблица 2

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для Фенпироксимата

2. Метод измерений

Метод основан на определении Фенпироксимата с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и очистки экстракта на концентрирующих патронах Диапак С и Диапак Амин.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С, относительной влажности не более 80 % и нормальном атмосферном давлении;

• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению определений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов Диапак С и Диапак Амин для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения Фенпироксимата на концентрирующих патронах Диапак С и Диапак Амин, установление градуировочной характеристики.

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °С, отбрасывают.

7.1.2. Очистка ацетона

Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцово-кислый калий из расчета 1 г/дм³.

Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °С, отбрасывают.

7.1.3. Приготовление бидистиллированной воды

Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцово-кислый калий из расчета 1 г/дм³ и кипятят в течение 6 ч.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °С, отбрасывают.

7.2. Приготовление растворов для проведения анализа

7.2.1. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.

В плоскодонную колбу объемом 1 дм³ помещают 800 см³ ацетонитрила и 200 см³ очищенной воды. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 см³/мин в течение 5 мин, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.

7.2.2. Приготовление градуировочных растворов

7.2.2.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией Фенпироксимата 1,0 мг/см³.

Взвешивают 50 мг Фенпироксимата в мерной колбе объемом 50 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 1 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.

7.2.2.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией Фенпироксимата 10,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 2 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 2 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией Фенпироксимата 1,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 3 используется для хроматографического исследования и приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 3 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией Фенпироксимата 0,5 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 4 используется для хроматографического исследования и приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 4 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией Фенпироксимата 0,2 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 50 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 5 используется для хроматографического исследования и приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 5 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией Фенпироксимата 0,1 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 6 используется для хроматографического исследования и приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 6 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.7. Стандартные растворы Фенпироксимата с концентрацией 10,0; 5,0; 2,0 и 1,0 мкг/см³ для внесения в контрольные образцы.

Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 10,0; 5,0; 2,0 и 1,0 мкг/см³ и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы.

7.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Фенпироксимата в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см³.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

7.4. Подготовка последовательно соединенных концентрирующих патронов Диапак С (внизу) и Диапак Амин (вверху) для очистки экстракта и проверка хроматографического поведения Фенпироксимата на них

7.4.1. Подготовка последовательно соединенных концентрирующих патронов Диапак С (внизу) и Диапак Амин (вверху) для очистки экстракта.

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин (1 - 2 кап./с).

Патрон Диапак Амин устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см³ (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1 и 10 см³ смеси гексана. Элюаты отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.4.2. Проверка хроматографического поведения Фенпироксимата на последовательно соединенных концентрирующих патронах Диапак С (внизу) и Диапак Амин (вверху).

Из стандартного раствора Фенпироксимата в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/см³, отбирают 1 см³, помещают в концентратор объемом 100 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 см³ гексана, перемешивают и вносят на подготовленные патроны. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 см³ ацетонитрила и хроматографируют.

Исходный концентратор обмывают двумя порциями по 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1 и последовательно вносят на патроны. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 см³ ацетонитрила и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие Фенпироксимат, полноту смывания с патронов и необходимый объем элюента.

Изучение поведения Фенпироксимата на концентрирующих патронах Диапак Амин и Диапак С проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.

7.5. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии

Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 с предколонкой Symmetry С8 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °С и скорости потока подвижной фазы 1 см³/мин 3 - 4 ч.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» от 21.08.1979 № 2051-79, а также в соответствии с ГОСТ 656-79 «Соки плодовые и ягодные натуральные. ТУ».

Пробы яблочного сока хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °С не более 5 суток.

9. Подготовка проб и выполнение измерений

9.1. Яблочный сок

9.1.1. Экстракция

Образец яблочного сока массой 10 г помещают в делительную воронку объемом 250 см³, прибавляют 10 см³ насыщенного раствора хлорида натрия и перемешивают. Туда же прибавляют 20 см³ ацетонитрила и встряхивают делительную воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой помещают в химический стакан объемом 50 см³, а верхний ацетонитрильный слой - в химический стакан объемом 100 см³. Повторяют экстракцию два раза, используя каждый раз по 20 см³ ацетонитрила и встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. Водный слой отбрасывают, а ацетонитрильный экстракт объединяют в химическом стакане объемом 100 см³. Объединенный ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку, выдерживают 5 мин при комнатной температуре, выделившуюся водную фазу (нижний слой) отбрасывают, а ацетонитрильный экстракт переносят через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 см , обмывают осушитель 10 см³ ацетонитрила, объединяют смыв с основным экстрактом и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К сухому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.1.1, прибавляют 5 см³ ацетона, 50 см³ дистиллированной воды и 10 см³ насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 см³. Фенпироксимат экстрагируют тремя порциями гексана по 20 см³, встряхивая каждый раз делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой помещают в химический стакан объемом 50 см³, а верхний гексановый слой собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.3. Очистка экстракта на последовательно соединенных концентрирующих патронов Диапак С (внизу) и Диапак Амин (вверху)

Сухой остаток, полученный в п. 9.1.2, растворяют в 1 см³ ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 см³ гексана, перемешивают и вносят на подготовленные патроны. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см³. Исходный концентратор обмывают 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1 и последовательно вносят на патроны. Элюат собирают в тот же концентратор объемом 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 10 см³ ацетонитрила и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.2. Условия хроматографирования

Хроматограф жидкостной Waters 515 с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу, номер госрегистрации № 15311-02 или другой с аналогичными характеристиками.

Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 250 мм×4,6 мм, зернение 5 мкм, фирма «Waters».

Предколонка стальная Symmetry С8, 20 мм×3,9 мм, зернение 5 мкм, фирма «Waters».

Температура колонки: 30 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода в соотношении 80:20.

Длина волны: 258 нм.

Время удерживания Фенпироксимата: 7,404 мин ± 2 %.

Чувствительность не менее 0,005 AUFS (единиц абсорбции на шкалу).

Объем вводимой пробы: 20 мм³.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

10. Обработка результатов

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа Empower 2.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание Фенпироксимата рассчитывают по формуле:

Х - содержание Фенпироксимата в пробе, мг/кг;

S_ст - высота (площадь) пика стандарта, мм;

S_пр - высота (площадь) пика образца, мм;

А - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г (см³);

Р - содержание Фенпироксимата в аналитическом стандарте, %.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

Х₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 × σ_r.

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

( ± Δ) мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

Δ = δ∙/100, где

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее 0,1 мг/кг»*,

* - 0,1 мг/кг - предел обнаружения.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

 - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

Δ_Л = ±0,84Δ, где

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

Δ = δ∙/100, где

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

К_к = -C_д, где

, , С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

Х₁, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

14. Разработчики

Калинин В.А., профессор, канд. с-х. наук, Довгилевич Е.В., ст.н.сотр., канд. биол. наук, Довгилевич А.В., ст.н.сотр., канд. хим. наук, Устименко Н.В., ст.н.сотр., канд. биол. наук, Щербинкина Е.Н., инженер.

Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева.

Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов». 127550, Москва, Тимирязевская ул., д. 53/1. Телефон: (495) 976-37-68, факс: (495) 976- 43-26.

Приложение 1

Полнота извлечения Фенпироксимата из яблочного сока.
(5 повторностей для каждой концентрации, Р = 0,95)