Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека

Сборник методических документов, необходимых
для обеспечения применения
Федерального закона от 12 июня 2008 г. № 88-ФЗ
«Технический регламент на молоко
и молочную продукцию»

Часть 4

В сборник включены методические документы, содержащие правила и методы исследований (испытаний) и измерений, а также правила отбора образцов для проведения исследований (испытаний) и измерений, в соответствии с постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации Г.Г. Онищенко от 08.12.2008 № 67.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
тетраметрина в мясе, печени, жире и молоке
сельскохозяйственных животных методом
высокоэффективной жидкостной
хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.2013-05

1. Методические указания разработаны Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (академик РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина); при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Разработчики методов указаны в каждом из них.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств тетраметрина
в мясе, печени, жире и молоке сельскохозяйственных
животных методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в мясе, печени, жире и молоке сельскохозяйственных животных массовых концентраций тетраметрина в диапазоне 0,1 - 2,0 мг/кг.

Тетраметрин - действующее вещество ветеринарного препарата НЕОСТОМАЗАН 55 г/л (д.в. тетраметрин 50 г/л + циперметрин 5 г/л), фирма производитель «Сева Санте Анималь» (Франция).

(1RS; 3RS; 1RS; 3SR)-2,2-диметил-3-(2-метилпроп-1-енил)циклопропаикарбоновой кислоты циклогекс-1-ен-1,2-дикарбокси-мидометиловый эфир (IUPAC)

C19H25NO4

Мол. масса 331,4

Бесцветное кристаллическое вещество со слабым запахом пиретрума. Температура плавления 68 - 70 °С. Давление паров при 25 °С: 2,1 мПа.

Плотность 1,1 (20 °С). Растворимость в органических растворителях: ацетон, этанол, метанол, гексан, н-октанол - более 20 г/дм³. Растворимость в воде - 1,83 мг/дм³ (при 25 °С). Коэффициент распределения в системе октанол/вода: K_owlogP - 4,6 (25 °С).

Тетраметрин разрушается в щелочах и сильных кислотах; DT₅₀: 16 - 20 дней (pH 5), 1 день (pH 7), менее 1 часа (pH 9). Устойчив в кетонах, хлороформе, ксилоле. Стабилен при хранении до 50 °С.

Краткая токсикологическая характеристика:

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 5000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для кроликов > 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LK₅₀) для крыс > 2,73 мг/дм³ (4 часа).

Область применения препарата

Тетраметрнин - инсектицид класса пиретроидов.

Препарат Неостомозан 55 г/л (д.в. циперметрин 50 г/л + тетраметрин 5 г/л) рекомендуется для борьбы с эктопаразитами (мухами, вшами, блохами, иксодовами клещами) животных - крупного рогатого скота, овец, лошадей, а также для лечения и профилактики псороптоза, демадекоза и чесотки.

Рекомендуемые МДУ тетраметрина в мышцах, печени, почках, жире, молоке - 0,2 мг/кг.

1. Метрологические характеристики метода

Метрологические характеристики метода представлены в табл. 1 и 2.

Таблица 1

Метрологические параметры

Таблица 2

Полнота извлечения тетраметрина из мяса, печени, жира говядины
и коровьего молока (5 повторностей для каждой концентрации)

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором (УФ) после экстракции из анализируемой пробы ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на колонке с флорисилом.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Нижний предел измерения в хроматографируемом объеме пробы - 50 нг.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %.

• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов и раствора внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонке.

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пенюксидом фосфора не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Очистка н-гексана и хлористого метилена

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 680 см³ ацетонитрила, 320 см³ деионизированной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

7.3. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 1,5 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.4. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения

7.4.1. Исходный раствор тетраметрина (концентрация 500 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помешают 0,05 г тетраметрина, растворяют в 50 - 70 см³ метанола, доводят метанолом до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3-х месяцев.

Растворы № 1 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.4.2. Рабочие растворы № 1 - 5 тетраметрина (концентрация 2,5 - 50,0 мкг/см³).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 см³ исходного раствора с концентрацией 500 мкг/см³ (п. 7.4.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы №№ 2 - 5 с концентрацией тетраметрина 5; 10; 25 и 50 мкг/см³, соответственно.

Для приготовления раствора № 1 с концентрацией тетраметрина 2,5 мкг/см³ в мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают 1,0 см исходного раствора с концентрацией 500 мкг/см³ (п. 7.4.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают.

Растворы хранятся в холодильнике не более месяца.

Рабочие растворы используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения тетраметрина из исследуемых образцов.

7.5. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации тетраметрина в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5-ти растворам для градуировки №№ 1 - 5.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

7.6. Подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, насыпают 5 г флорисила, медленно наливают в колонку (при открытом кране) 15 - 20 см³ гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помешают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонка готова к работе.

7.7. Проверка хроматографического поведения тетраметрина на колонке с флорисилом

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ рабочего раствора № 5 с концентрацией тетраметрина 50 мкг/см³ (п. 7.3.2), растворитель упаривают досуха, остаток растворяют в 5 см³ гексана и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают трижды порциями гексана по 3 см³, которые также наносят на колонку. Промывают колонку 50 см³ гексана, элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают 120 см³ смеси гексан-диэтиловый эфир (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек. Фракционно (по 10 см³) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 см³ ацетонитрила, анализируют по п. 9.4.

Фракции, содержащие тетраметрин, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.

Примечание: Проверку хроматографического поведения тетраметрина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

8. Отбор проб

Отбор продуктов питания осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТов на исследуемые продукты: ГОСТ 7269-79 «Мясо», ГОСТ 3622-68 «Молоко и молочные продукты».

Обобранные образцы продуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки, стеклянные банки с притертыми крышками. Образцы анализируют непосредственно после отбора проб или хранят в морозильной камере при - 18 °С.

Непосредственно перед анализом образцы размораживают, пробы органов и тканей массой 200 - 300 г тщательно измельчают с использованием гомогенизатора. Пробу гомогенизированного образца мяса печени и жира, а также молока массой 50 г взвешивают на аналитических весах в плоскодонных колбах вместимостью 250 см³.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция

К пробе гомогенизированного образца органов животных, а также молока массой 50 г, помещенной в колбу вместимостью 250 см³, приливают 100 см³ ацетонитрила, тщательно перемешивают путем встряхивания в течение 5 мин, выдерживают на ультразвуковой бане 1 мин, затем на встряхивателе - 30 мин и помещают на 12 - 15 часов в холодильник (4 - 6 °С).

Надосадочную жидкость осторожно переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 см³ фильтруя ее через тампон из стекловаты, помещенный в конусную химическую воронку.

Для более полного разделения фаз эмульсионный слой пробы молока переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин., затем отделившийся раствор объединяют с первой порцией надосадочной жидкости в круглодонной колбе.

Раствор упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 40 °С до объема 40 - 50 см³ (приблизительно в 2 раза), внимательно следя за процессом, не допуская вспенивания и переброса жидкости, затем очищают перераспределением по п. 9.2.

9.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Сконцентрированный раствор, полученнбый по п. 9.1, переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³, вносят в нее 150 см³ деионизованной воды, 5 см³ насыщенного раствора хлористого натрия и 50 см³ смеси гексан-диэтиловый эфир (1:1, по объему), интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний слой возвращают в круглодонную колбу, верхний фильтруют через 2-х см. слой сульфата натрия (помещенный в конусную химическую воронку на бумажном фильтре) в круглодонную колбу вместимостью 250 см³. Водную фазу переносят в делительную воронку и операцию экстракции повторяют новой порцией смеси гексан-диэтиловый эфир (1:1, по объему) объемом 50 см³.

Профильтрованный объединенный экстракт упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 20 см³ ацетонитрила, насыщенного гексаном, и переносят в делительную воронку вместимостью 150 см³, добавляют 20 см³ гексана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин. Разделившиеся фазы переносят в отдельные конические колбы. Нижний ацетонитрильный слой возвращают в делительную воронку, вносят новую порцию гексана объемом 20 см³ и операцию экстракции повторяют. Затем нижний ацетонитрильный слой переносят в круглодонную колбу вместимостью 150 см³, к оставшемуся в воронке гексану приливают ранее отделенный гексановый слой, вносят 10 см³ ацетонитрила, насыщенного гексаном, встряхивают 1 мин. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой объединяют с первым экстрактом, помещенным в круглодонную колбу, упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.1.3.

9.3. Очистка экстракта на колонке с флорисилом

Остаток, полученный по п. 9.2, находящийся в круглодонной колбе, растворяют в 5-ти см гексана и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают трижды порциями гексана по 3 см³, которые также наносят на колонку. Промывают колонку 50 см³ гексана, элюат отбрасывают.

Тетраметрин элюируют с колонки 100 см³ смеси гексан-диэтиловый эир (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек, собирая элюат в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 40 °С, остаток в колбе растворяют в 2-х см³ ацетонитрила и анализируют содержание тетраметрина по п. 9.4.

9.4. Условия хроматографирования

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах: Колонка стальная, длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая Кромасил 100 С 18, зернением 8 мкм

Температура колонки: комнатная

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (680:320, по объему)

Скорость потока элюента: 1,5 см³/мин

Рабочая длина волны: 280 нм

Чувствительность: 0,01 ед. абсорбции на шкалу

Объем вводимой пробы: 20 мм³

Ориентировочное время выхода тетраметрина: 10,3 - 10,5 мин.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор тетраметрина с концентрацией 50 мкг/см³, разбавляют ацетонитрилом.

10. Обработка результатов анализа

Содержание тетраметрнина в пробе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

А - концентрация тетраметрина, найденная по градуировочному графику, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г.

11. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1 - 6.2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

12. Разработчики

Юдина Т.В., Федорова Н.Е., Волкова В.Н., - Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (ФНЦГ им. Ф.Ф.Эрисмана).

СОДЕРЖАНИЕ