Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных
количеств химических веществ
в объектах окружающей среды, атмосферном
воздухе, воздухе рабочей зоны
и сельскохозяйственной продукции

Сборник методических указаний
МУК 4.1.1960, 4.1.1961, 4.1.1963 - 4.1.1980-05

1. Разработаны Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром «Токсикология пестицидов и агрохимикатов» (Калинин В.А., Калинина Т.С., Рыбакова О.И., Калинин А.В.).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-гигиеническому нормированию Минздрава России (протокол № 1 от 31 марта 2005 г.).

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 21 апреля 2005 г.

4. Введены в действие с 1 июля 2005 г.

5. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств протиоконазола
по его основному метаболиту протиоконазол-дестио
в зерне и соломе зерновых колосовых культур
методом газожидкостной хроматографии

1. Вводная часть

Действующее вещество: протиоконазол (JAU 6476)

2-[(2К8)-2-(1-хлорциклопропил)-3-(2-хлорфенил)-2-оксипропил]-2Н-1,2, 4-триазол-3(4Н)-тион (ИЮПАК)

2-[2-(1-хлорциклопропил)-3-(2-хлорфенил)-2-оксипропил]-1,2-дигидро-3Н-1,2,4-триазол-3-тион (С.А.).

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₄H₁₅Cl₂N₃OS.

Молекулярная масса: 344,3.

Бесцветное или светло-бежевое твердое вещество без запаха.

Температура плавления: 139,1 - 144,5 °С.

Давление паров при 20 °С: << 4×10^-7 Па.

Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_owlogP = 4,16 (рН 4), 3,82 (рН 7) и 2,0 (рН 9).

Растворимость (г/л) при 20 °С: ацетон - более 250, этилацетат - более 250, дихлорметан - 88, ацетонитрил - 69; растворимость в воде - 0,005 (рН 4), 0,3 (рН 8) и 2,0 (рН 9).

Вещество стабильно при хранении на воздухе, а также в кислой (DT₅₀ = 120 дней) и щелочной (DT₅₀ = > 1 года) средах.

В присутствии света в водных фотолитических условиях протиоконазол достаточно быстро деградирует с периодом полураспада 47,7 ч.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 6200 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 4990 мг/м³ воздуха.

Протиоконазол не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз, не обладает эмбриотоксическим или тератогенным действием. LC₅₀ для рыб - 1,83 мг/л (96 ч).

Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел, дождевых червей, дафний и почвенных микроорганизмов.

Основной метаболит протиоконазола: протиоконазол-дестио (SXX 0665).

α-(1-хлорциклопропил)-α-(2-хлорфенил)метил-1Н-1,2,4-триазол-1-этанол (С.А.).

Эмпирическая формула: C₁₄H₁₅Cl₂N₃O.

Молекулярная масса: 312,2.

Бесцветный порошок без запаха.

Температура плавления: 108,5 °С.

Давление паров при 20 °С: 2,7×10^-7 Па.

Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_owlogP = 3,04.

Растворимость (г/л) при 20 °С: гексан - 3, толуол - 84, ацетон - 100, ацетонитрил - 43, дихлорметан - более 200, вода - 0,051.

Метаболит стабилен в кислой и щелочной средах (DT₅₀ = > 500 ч).

Другие физико-химические и токсикологические характеристики протиоконазол-дестио отсутствуют.

Гигиенические нормативы для протиоконазола и протиоконазол-дестио в России не установлены.

Область применения препарата

Протиоконазол - фунгицид системного действия из группы ингибиторов синтеза эргостерина. Вещество обладает защитным, искореняющим и лечебным действием. При обработке вегетирующих растений оно эффективно подавляет развитие возбудителей ржавчины, мучнистой росы, септориоза, фузариоза колоса, ломкости стеблей и пятнистостей листьев на посевах ячменя, пшеницы и других культур, а при протравливании семян защищает последние от заражения твердой и пыльной головней и фузариозной корневой гнилью.

Протиоконазол весьма лабильное вещество и при поступлении в растение очень быстро метаболизируется до более устойчивого соединения - протиоконазол-дестио (α-(1-хлорциклопропил)-α-(2-хлорфенил) метил-1Н-1,2,4-1-этанол) /SXX 0665/. В связи с этим разработан метод, позволяющий осуществлять контроль за содержанием остаточных количеств протиоконазола в зерне и соломе зерновых колосовых культур по протиоконазол-дестио.

2. Методика определения остаточных количеств
протиоконазола по его основному метаболиту
протиоконазол-дестио в зерне и соломе зерновых
колосовых культур методом газожидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на газохроматографическом определении протиоконазол-дестио (SXX 0665) с ЭЗД на неподвижной фазе OV-17 после экстракции его из растительного материала водным ацетоном, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с оксидом алюминия и концентрирующем патроне Диапак-диол.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в интенсивной технологии выращивания зерновых колосовых культур.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Таблица

Метрологические параметры метода

2.2. Реактивы, растворы, материалы

2.3. Приборы, аппаратура, посуда

2.4 Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (от 21.08.79 № 2051-79).

Отобранные пробы зерна и соломы досушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при комнатной температуре или в холодной комнате при температуре 4 °С. Перед анализом зерно и солому размалывают на лабораторной мельнице.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем растворители последовательно промывают водой, 2 %-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г KMnO₄ и 2 г K₂CO₃.

Этилацетат промывают равным объемом 5 %-го раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

Оксид алюминия III степени активности по Брокману получают добавлением 4,6 % воды к навеске оксида алюминия фирмы Мерк (Германия) I степени активности.

2.5.2. Подготовка и кондиционирование колонки

Готовую насадку (3 % OV-17 на Хромосорбе W/HP) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостат хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 250 °С в течение 8 - 10 ч.

2.5.3. Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор протиоконазол-дестио с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,0102 г вещества, содержащего 98,5 % д.в., в этилацетате в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре -12 °С не более месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора метаболита соответствующим последовательным разведением этилацетатом.

При изучении полноты открывания протиоконазол-дестио в модельных матрицах используются ацетоновые растворы вещества.

2.5.4. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 2 мкл рабочего стандартного раствора протиоконазол-дестио с концентрацией 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение площади хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ × с от концентрации протиоконазол-дестио в растворе в мкг/мл.

2.5.5. Подготовка колонки с оксидом алюминия и
концентрирующего патрона Диапак-диол для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 0,8 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г оксида алюминия III степени активности по Брокману в 20 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 15 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон Диапак-диол промывают сначала с помощью медицинского шприца 10 мл смеси дихлорметан-ацетон (1:1, по объему), а затем 8 мл смеси гексан-дихлорметан (7:3, по объему) со скоростью 5 мл/мин.

2.5.6. Проверка хроматографического поведения протиоконазол-дестио
на колонке с оксидом алюминия

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора протиоконазол-дестио с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель потоком теплого воздуха, остаток растворяют в 3 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) и наносят на подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 30 мл элюента № 1 (смесь гексан-этилацетат, 85:15) и затем 30 мл элюента № 2 (смесь гексан-этилацетат, 70:30) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 5 мл каждая, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют на содержание протиоконазол-дестио по п. 2.7.

Фракции, содержащие протиоконазол-дестио, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 5 мл этилацетата и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: Профиль вымывания протиоконазол-дестио может меняться при использовании новых партий сорбента и растворителей.

2.6. Описание определения

2.6.1. Экстракция протиоконазол-дестио

К навеске размолотого зерна (20 г) или соломы (5 г) добавляют 100 мл 70 %-го водного ацетона и суспензию перемешивают в течение 1 часа на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 250 мл. Осадок на фильтре промывают 50 мл 70 %-ного водного ацетона. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (соответственно около 35 и 25 мл), эквивалентную 5 г зерна или 1 г соломы. Дальнейшую очистку проводят по пп. 2.6.2, 2.6.3 и 2.6.4.

2.6.2. Очистка экстракта

Отобранные аликвоты растительного экстракта (из п. 2.6.1) упаривают до водной фазы (объем около 5 мл) на роторном испарителе при температуре 40 °С. Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 20 мл бидистиллированной воды, 30 мл дихлорметана и смесь встряхивают в течение 1 минуты. После разделения слоев собирают органическую фракцию, а водную фазу обрабатывают дихлорметаном еще два раза (30 + 20 мл). Объединенный дихлорметановый экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С.

2.6.3. Очистка на колонке с оксидом алюминия

К остатку в колбе, полученному при упаривании очищенных по п. 2.6.2 экстрактов растительного материала, приливают 3 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) и помещают в ультразвуковую баню на 3 минуты. Раствор переносят в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 25 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему), которые отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют 25 мл смеси гексан-этилацетат (70:30, по объему) в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °С. Сухой остаток экстракта зерна растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют по п. 2.7. Экстракт соломы подвергают дополнительной очистке на концентрирующем патроне Диапак-диол.

2.6.4. Очистка на концентрирующем патроне Диапак-диол

Сухой остаток экстракта соломы из п. 2.6.3 переносят двумя 1-мл порциями смеси гексан-дихлорметан (7:3, по объему) в подготовленный концентрирующий патрон Диапак-диол (п. 2.5.5). Патрон промывают 5 мл смеси гексан-дихлорметан (1:1, по объему) со скоростью 5 мл/мин, которые отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют 12 мл дихлорметана. Элюат упаривают досуха в грушевидной колбе емкостью 50 мл на роторном испарителе при температуре 30 °С. Для удаления следовых количеств дихлорметана в колбу приливают 5 мл гексана и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют по п. 2.7.

2.7. Условия хроматографирования

Газовый хроматограф «Кристалл 2000М» с электронозахватным детектором (Ni⁶³) с пределом детектирования по линдану не выше 3,18×10^-14 г/с.

Колонка хроматографическая, стеклянная, 1000×3 мм, неподвижная фаза - 3 % OV-17 на Хромосорбе W/HP (0,12 - 0,15 мм).

Температура детектора - 320 °С, испарителя - 270 °С, термостата колонки - 230 °С.

Скорость потока газа-носителя (азот) - 30 мл/мин; поддув - 25 мл/мин.

Объем вводимой пробы - 2 мкл.

Время удерживания протиоконазол-дестио - 2 мин 28 с.

Линейный диапазон детектирования: 0,1 - 1 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/мл, разбавляют этилацетатом.

2.8. Обработка результатов анализа

Содержание протиоконазол-дестио рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

Х - содержание протиоконазол-дестио в пробе, мг/кг;

H₁ - площадь пика образца, мВ⋅с;

H₀ - площадь пика стандарта, мВ⋅с;

А - концентрация стандартного раствора протиоконазол-дестио, мкг/мл;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

m - масса анализируемой части образца, г (для зерна - 5 г, для соломы - 1 г).

При установлении уровня протиоконазола полученное значение содержания протиоконазола-дестио (X) умножают на 1,1.

3. Требования техники безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.

4. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1 - 6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

5. Разработчики

Дубовая Л.В., Макеев А.М.

ВНИИ фитопатологии, 143050 Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел. 592-92-20.