Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных
количеств химических веществ
в объектах окружающей среды, атмосферном
воздухе, воздухе рабочей зоны
и сельскохозяйственной продукции

Сборник методических указаний
МУК 4.1.1960, 4.1.1961, 4.1.1963 - 4.1.1980-05

1. Разработаны Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром «Токсикология пестицидов и агрохимикатов» (Калинин В.А., Калинина Т.С., Рыбакова О.И., Калинин А.В.).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-гигиеническому нормированию Минздрава России (протокол № 1 от 31 марта 2005 г.).

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 21 апреля 2005 г.

4. Введены в действие с 1 июля 2005 г.

5. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств протиоконазола
и его основного метаболита протиоконазола-дестио
в воде, протиоконазола и протиоконазола-дестио
по метаболиту протиоконазолу-дестио в почве методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации протиоконазола и его основного метаболита протиоконазола-дестио в воде в диапазоне 0,0005 - 0,01 мг/дм³, протиоконазола и протиоконазола-дестио по метаболиту протиоконазолу-дестио в почве в диапазоне 0,01 - 0,2 мг/кг.

2-[(RS)-2-гидрокси-2-(1-хлорциклопропил)-3-(2-хлорфенил)пропил]-2Н-1,2,4-триазол-3(4Н)-тион(IUPAC)

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₄H₁₅Cl₂N₃OS.

Молекулярная масса: 344,3.

Белое или светло-бежевое твердое вещество без запаха. Температура плавления: 139,1 - 144,5 °С. Давление паров при 20 °С: << 4×10^-7 Па. Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_ow logP = 4,16 (рН 4), 3,82 (рН 7) и 2,0 (рН 9). Растворимость (г/дм³) при 20 °С: ацетон - более 250, этилацетат - более 250, дихлорметан - 88, ацетонитрил - 69; растворимость в воде - 0,005 (рН 4), 0,3 (рН 8) и 2,0 (рН 9).

Вещество стабильно при хранении на воздухе, а также в кислой (DT₅₀ = 120 дней) и щелочной (DT₅₀ > 1 года) средах. В присутствии света в водных фотолитических условиях протиоконазол достаточно быстро деградирует с периодом полураспада 47,7 часа. Основным продуктом фотодеградации является протиоконазол-дестио, его содержание составляет до 56 %.

В почве в полевых условиях протиоконазол подвергается быстрой деградации, ДT₅₀ составляет 1,3 - 2,8 дней (в среднем 1,7 дней), ДT₉₀ - 4,4 - 9,3 дня (в среднем 5,8 дней). Отмечена заметная сорбция протиоконазола почвой. Основным почвенным метаболитом является протиоконазол-дестио. ДT₅₀ протиоконазола-дестио в почве в полевых условиях составляет 16,3 - 72,3 дня (в среднем 42 дня), ДT₉₀ - 54,1 - 240 дней (в среднем 140 дней). Протиоконазол-дестио детектирован на пределе обнаружения (6 мкг/кг) в 10 - 20 см слое. Максимальные его уровни наблюдались в период от 1 до 28 дней после применения, полное исчезновение (менее 6 мкг/кг) после 55 - 240 дней.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 6200 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс - более 4990 мг/м³ воздуха.

Протиоконазол не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз.

Основной метаболит протиоконазола: протиоконазол-дестио (SXX 0665)

α-(1-хлорциклопропил)-α-(2-хлорфенил)метил-1Н-1,2,4-триазол-1 этанол (С.А.)

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₄H₁₅Cl₂N₃O.

Молекулярная масса: 312,2.

Бесцветный порошок без запаха. Температура плавления: 108,5 °С. Давление паров при 20 °С: 2,7×10^-7 Па. Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_ow logP = 3,04.

Растворимость (г/дм³) при 20 °С: гексан - 3, толуол - 84, ацетон - 100, ацетонитрил - 43, дихлорметан - более 200, вода - 0,051. Стабилен в кислой и щелочной средах (DT₅₀ > 5000 ч).

Область применения препарата

Протиоконазол - фунгицид системного действия из группы ингибиторов синтеза эргостерина. Вещество обладает защитным, искореняющим и лечебным действием.

1. Метрологические характеристики метода

Метрологические характеристики метода представлены в таблице.

Таблица

Метрологические параметры

2. Метод измерений

Методика основана на определении веществ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором. Для концентрирования и очистки пробы воды использованы патроны для твердофазной экстракции С18 Sep Pak. Контроль протиоконазола и его основного метаболита протиоконазола-дестио в образцах почвы осуществляется по содержанию протиоконазола-дестио после экстракции из анализируемого образца смесью ацетонитрил-вода, очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с оксидом алюминия.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

3.2. Реактивы

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %.

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с оксидом алюминия и концентрирующих патронов С18 Sep Раk.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения ее окрашивания в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.3. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5 %-м водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия, перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.2. Приготовление 0,02 М раствора ортофосфорной кислоты

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 1,36 см³ 85 %-й ортофосфорной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

7.3. Приготовление 0,05 %-го раствора уксусной кислоты

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 300 - 400 см³ дистиллированной воды, вносят 0,5 см³ ледяной уксусной кислоты, перемешивают, доводят водой до метки, вновь перемешивают.

7.4. Подготовка колонки с оксидом алюминия
для очистки экстракта

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г оксида алюминия в 15 - 20 см³ смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 см³ этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в с, затем 20 см³ смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему). После этого колонка готова к работе.

7.5. Проверка хроматографического поведения
протиоконазола-дестио на колонке с оксидом алюминия

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ градуировочного раствора № 1 протиоконазола-дестио с концентрацией 10 мкг/см³ в ацетонитриле (п. 7.9.2), раствор упаривают досуха, остаток растворяют в 0,5 см³ этилацетата, помещая на ультразвуковую баню на 1 мин., добавляют 2,5 см³ гексана, перемешивают, вновь помещают на ультразвуковую баню на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.4. Промывают колонку 25 см³ смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек, элюат отбрасывают. Затем колонку промывают 50 см³ смеси гексан-этилацетет (60:40, по объему). Фракционно (по 10 см³) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 см³ ацетонитрила, помещая на ультразвуковую баню на 1 мин., вносят 1 см³ подвижной фазы, подготовленной по п. 7.3, перемешивают и анализируют на содержание протиоконазола-дестио по п. 9.3.

7.6. Подготовка концентрирующего патрона С18 Sep Pak

Концентрирующий патрон промывают с помощью медицинского шприца 2 см³ метанола со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 - 2 капли в с, затем 5 см³ 0,05 %-ного раствора уксусной кислоты. Патрон готовят непосредственно перед использованием для концентрирования образца.

7.7. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 600 см³ ацетонитрила, 400 см³ 0,02 М раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

7.8. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.7) при скорости подачи растворителя 1 см³/мин. не менее 2-х часов до установления стабильной базовой линии.

7.9. Приготовление градуировочных растворов

7.9.1. Исходные растворы протиоконазола и протиоконазола-дестио для градуировки (концентрация 500 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,05 г протиоконазола (или протиоконазола-дестио), растворяют в 40 - 50 см³ ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Растворы хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение 3-х месяцев.

7.9.2. Растворы протиоконазола и протиоконазола-дестио № 1 для градуировки (концентрация 10 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 2 см³ исходного раствора протиоконазола (или протиоконазола-дестио) с концентрацией 500 мкг/см³ (п. 7.9.1), разбавляют ацетонитрилом до метки.

Этот раствор используют для приготовления проб воды с внесением при оценке полноты извлечения протиоконазола и протиоконазола-дестио из исследуемых образцов. Для внесения в образцы почвы используют растворы с концентрацией 10 мкг/см³, приготовленные в смеси метанол-вода-цистеин гидрохлорид (100:900:0,01; объем/объем/вес).

Градуировочные растворы № 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение месяца.

7.9.3. Рабочие растворы № 2 - 5 протиоконазола и протиоконазола-дестио для градуировки (концентрация 0,05 - 1,0 мкг/см³).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают по 0,5; 1,0; 5,0 и 10,0 см³ градуировочного раствора № 1 протиоконазола (или протиоконазола-дестио) с концентрацией 10 мкг/см³ (п. 7.9.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.7, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы №№ 2 - 5 с концентрацией протиоконазола (или протиоконазола-дестио) 0,05; 0,1; 0,5 и 1,0 мкг/см³, соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед употреблением.

7.10. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (отн. единицы) от концентрации протиоконазола (или протиоконазола-дестио) в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб», 17.4.3.01-83 «Почвы. Общие требования к отбору проб», 26950-89 «Почвы. Отбор проб».

Пробы воды анализируют в день отбора или замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре -18 °С не более 2 недель.

Образцы почвы подсушивают на воздухе в темноте, помещают в герметичную полиэтиленовую тару и хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °С не более 4 недель.

Для длительного хранения образцы почвы замораживают и хранят при температуре -18 °С.

Перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр, почвы - просеивают через сито с диаметром отверстий 1 мм.

9. Выполнение определения

9.1. Вода

Образец отфильтрованной воды объемом 200 см³ помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 - 300 см³ с пришлифованной пробкой, вносят 0,01 г цистеина гидрохлорида и 0,1 см³ ледяной уксусной кислоты, тщательно перемешивают.

Подготовленную пробу вносят с помощью медицинского шприца на концентрирующий патрон С18 Sep Pak, подготовленный по п. 7.6 со скоростью пропускания раствора 1 - 2 капли в с. Операцию осуществляют в затемненном помещении. После нанесения пробы патрон промывают 5 см³ смеси ацетонитрил - 0,05 %-ая уксусная кислота (2:8, по объему), элюат отбрасывают. Вещества элюируют с патрона 2 см³ смеси ацетонитрил - 0,05 %-ая уксусная кислота (9:1, по объему), собирая элюат в градуированную пробирку с пришлифованной пробкой, перемешивают и анализируют на содержание протиоконазола и протиоконазола-дестио по п. 9.3.

9.2. Почва

9.2.1. Экстракция

Образец сухо-воздушной почвы массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 см³, добавляют 100 см³ смеси ацетонитрил-вода (80:20, по объему) и помещают на встряхиватель на 1 ч.

Раствор (с осадком почвы) фильтруют в мерный цилиндр вместимостью 100 см³ с пришлифованной пробкой через складчатый бумажный фильтр, помещенный на конусную воронку. Осадок на фильтре промывают 25 см³ смеси ацетонитрил-вода (80:20, по объему). Экстракт и промывную жидкость, объединенные в мерном цилиндре, перемешивают, измеряют объем раствора, 1/2 его часть (эквивалентную 10 г образца) переносят в круглодонную колбу. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.2.

9.2.2. Очистка экстракта перераспределением в системе
несмешивающихся растворителей

Экстракт, полученный по п. 9.2.1 и помещенный в круглодонную колбу, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (~10 см³) при температуре не выше 35 °С, внимательно следя за процессом и не допуская переброса жидкости при вспенивании. К водному остатку прибавляют 40 см³ деионизованной воды и 5 г хлорида натрия, перемешивают до полного растворения соли и переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³. В воронку вносят 30 см³ хлористого метилена, интенсивно встряхивают воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 150 см³. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 25 см³ хлористого метилена. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.2.3.

9.2.3. Очистка экстракта на колонке с оксидом алюминия

Остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2.2, растворяют в 0,5 см³ этилацетата, помещая на ультразвуковую баню на 1 мин., добавляют 2,5 см³ гексана, перемешивают, вновь помещают на ультразвуковую баню на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.4. Колбу обмывают трижды порциями по 3 см³ смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 25 см³ смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в с, элюат отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют с колонки 40 см³ смеси гексан-этилацетат (60:40, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С. Остаток в колбе растворяют в 1 см³ ацетонитрила, помещая на ультразвуковую баню на 1 мин., вносят 1 см³ подвижной фазы, подготовленной по п. 7.3, перемешивают и анализируют на содержание протиоконазола-дестио по п. 9.3.

9.3. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором (фирмы Perkin-Elmer, США).

Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая кромасил 100 С18, зернением 8 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,02 М ортофосфорная кислота (60:40, по объему).

Скорость потока элюента: 1 см³/мин.

Рабочая длина волны: 213 нм.

Чувствительность: 0,01 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 мм³.

Ориентировочное время выхода протиоконазола-дестио: 6,4 - 6,6 мин.; протиоконазола: 9,4 - 9,7 мин.

Линейный диапазон детектирования 1 - 20 нг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочные растворы с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.3.

10. Обработка результатов анализа

10.1. Вода

Содержание протиоконазола в пробе с учетом его основного метаболита протиоконазола-дестио в эквиваленте действующего вещества (X, мг/дм³) рассчитывают по формуле:

А, Б - концентрации протиоконазола и протиоконазола-дестио, соответственно, найденные по градуировочным графикам, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

W - объем анализируемого образца, см³.

К - коэффициент пересчета содержания протиоконазола-дестио на эквивалент протиоконазола, по соотношению молекулярных масс (равен 1,103).

10.2. Почва

Содержание протиоконазола в пробе с учетом его основного метаболита протиоконазола-дестио в эквиваленте действующего вещества (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

Б - концентрация протиоконазола-дестио, найденная по градуировочному графику, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г.

K - то же, что и в п. 10.1.

С - коэффициент пересчета на полный объем экстракта (равен 2).

11. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1 - 6.2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

12. Разработчики

Юдина Т.В., Федорова Н.Е., Волкова В.Н. (Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана); Брагина И.В. (Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора).