УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный

врач Российской Федерации,

Первый заместитель Министра

здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

24 июня 2003 г.

Дата введения - 30 июня 2003 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств дикамбы в зерне, соломе, зеленой массе растений, воде и почве газожидкостной и тонкослойной хроматографией

Методические указания

МУК 4.1.1452-03

1. Вводная часть

Фирма-производитель: «Гарда», Индия.

Торговое название: дикамба.

Название действующего вещества по ISO: дикамба.

Название действующего вещества по IUPAC: 3,6 - дихлор-о-анисовая кислота.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: С₈Н₆С1₂О₃.

Молекулярная масса: 221,05.

В чистом виде белые кристаллы с Т_пл, 114 - 116 °C. Упругость паров при 25 °C 4,5 · 10^-3 Па (3,4 · 10^-5 мм рт. ст.) Разлагается при 200 °C. Растворимость при 25 °C в воде 6,5 г/л, ацетоне 810 г/л, дихлорметане 260 г/л, диоксане 1,18 г/л, этаноле 922 г/л. Растворимость в воде натриевой соли 360 г/л, калиевой соли - 480 г/л, диметиламинной соли 720 г/л по эквиваленту кислоты.

Коэффициент распределения n-октанол - вода Log K_ow 0,60 (при pH 5); - 0,80 (при pH 7); - 0,24 (при pH 9).

ПДК в воде 0,02 мг/л, ПДК в почве 0,2 - 0,25 мг/кг.

МДУ в зерне хлебных злаков «не допускается». Норматив «не допускается» установлен при нижнем пределе методом ТСХ 0,3 - 0,5 мг/кг и методом ГЖХ 1,5 мг/кг см. в книге «Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде» /Под ред. М.А. Клисенко, М.: Колос, 1997, с. 188 - 238.

МДУ в США в зерне - 0,5 мг/кг, в молоке - 0,05 мг/кг.

2. Методика определения дикамбы в зерне, соломе, зеленой массе растений, воде и почве

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на извлечении дикамбы из подкисленной пробы диэтиловым эфиром, очистке экстракта перераспределением в водно-щелочную среду, а затем, после подкисления раствора, в хлороформ с последующей доочисткой сублимацией в вакууме. Для зеленой массы растений перед сублимацией проводится очистка активированным углем.

Определение дикамбы проводят ГЖХ в виде метилового эфира или ТСХ.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в табл. 1.

2.1.3. Избирательность метода

Таблица 1

Метрологическая характеристика метода

Объект	Нижний предел определения, мг/кг	Диапазон измеряемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения С, при n = 25, %	Стандартное отклонение, S при n = 25, ± %	Доверительный интервал среднего определения при n = 5, n = 0,95, %	Размах варьирования R, %
1	2	3	4	5	6	7
ГЖХ
Зерно (ячмень, овес, пшеница, рожь)	0,005	0,005 - 0,1	84,2	9,7	84,2 ± 13,5	72 - 110
Солома	0,02	0,02 - 0,4	81,8	10,2	81,8 ± 14,1	65,4 - 103
Зеленая масса	0,02	0,02 - 0,4	82,5	11,6	82,5 ± 16,1	60,4 - 112
Вода	0,0002	0,0002 - 0,004	75,6	12,8	75,6 ± 17,6	70,3 - 98,5
Почва	0,005	0,005 - 0,1	85,5	9,6	85,5 ± 13,4	73 - 100
ТСХ
Зерно (ячмень, овес, пшеница, рожь)	0,25	0,25 - 0,5	77	10	77 ± 14	60 - 100
Солома	1,0	1 - 5	79	13	79 ± 18	60 - 100
Зеленая масса	1,0	1 - 5	78	8	78 ± 11	70 - 90
Почва	0,25	0,25 - 0,5	78	9	78 ± 13	72 - 95

Метод селективен. Селективность метода обеспечивается сочетанием метода ГЖХ с использованием двух альтернативных колонок, а ТСХ - двух альтернативных систем подвижных растворителей.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетон, хч, перегнанный над КМnO₄ и обезвоженный над Na₂SO₄ безводным

ГОСТ 2603-79

Гексан, хч, свежеперегнанный ТУ 6-09-3375-78

Хлороформ, хч ГОСТ 20015-74

Диэтиловый эфир, хч ГОСТ 6265-79

Кислота ортофосфорная, Н₃РO₄, хч, 2 %-й раствор, по объему ГОСТ 6552-80

Калия хлорид, хч, 20 %-й раствор в 0,5 %-м растворе KOH ГОСТ 4161-77

Калия гидроксид, хч, 0,5 %-й раствор ГОСТ 24363-80

Натрия сульфат, хч, безводный ГОСТ 4166-76

Хроматон N-AW-DMCS с 5 % SE-30 (0,16 - 0,2 мм) или аналогичный носитель

Хроматон N-AW-DMCS с 5 % OV-17 (0,16 - 0,2 мм) или аналогичный носитель

Активированный уголь, БАУ ТУ 6-09-3247-73

Кислота серная, осч ГОСТ 14262-78

Серебро азотнокислое, AgNO₃ ГОСТ 1277-75

Аммиак, концентрированный ГОСТ 3760-79

Азот осч, из баллона с редуктором ГОСТ 9293-74

Кислота уксусная, ледяная, чда ГОСТ 61-75

Гидразин-гидрат, чда ГОСТ 58322-65

Метиловый спирт, хч ГОСТ 6995-77

Кальция хлорид, хч ГОСТ 4460-77

Стеариновая или любая твердая органическая кислота

Дикамба, с содержанием д.в. не менее 95 %

Стандартный раствор дикамбы в ацетоне с концентрацией 100 мкг/мл (раствор 1) и 1 мкг/мл (раствор 2)

2.3. Приборы, аппаратура и посуда

Газожидкостный хроматограф Цвет 500 М или аналогичный с детектором «по захвату электронов»

Хроматографические колонки длиной 170 см и 200 см, внутренним диаметром 3 мм

Камера хроматографическая или аналогичная ГОСТ 25336-82

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М ТУ 25-11-917-76

или аналогичный с набором колб ГОСТ 25336-82

Прибор для микросублимации в вакууме (рис. 1)

Прибор для получения диазометана (рис. 2)

Кофейная мельница

Мерные колбы, вместимостью 100 мл ГОСТ 1770-74

Пипетки с делениями, на 5,1 мл ГОСТ 20292-74

Пульверизаторы стеклянные ГОСТ 25336-82

Посуда лабораторная стеклянная ГОСТ 25336-82

ГОСТ 1770-74

ГОСТ 9737-70

Градуированные пробирки с пробками на шлифах, вместимостью 5 мл

ГОСТ 1770-74

Делительные воронки, вместимостью 150 мл, 1000 мл ГОСТ 25336-82

Хроматографические пластинки «Силуфол», Чехия

Хроматографические пластинки «Сорбфил», 10´10 см ТУ 26-11-17-89

Баня водяная или аналогичная ТУ 64-1-2850-76

Лампа ртутно-кварцевая или аналогичная ТУ 16-535-280-74

Микрошприцы МШ-10, на 10 мкл и МШ-100 на 100 мкл или аналогичные

Почвенное сито

Механический встряхиватель

2.4. Отбор проб

Отбор проб для анализа проводят в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», утвержденными Минздравом СССР от 21.08.79 № 2051-79.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Приготовление стандартных растворов

Для приготовления стандартного раствора 1 с содержанием 100 мкг/мл в мерную колбу вместимостью 100 мл помещают навеску дикамбы (10 мг), взятую с точностью до ± 0,2 мг. Навеску растворяют в ацетоне и доводят до метки тем же растворителем.

Для приготовления раствора 2 из раствора 1 пипеткой отбирают 1 мл и переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят до метки ацетоном.

Стандартные растворы стабильны при хранении в холодильнике в течение 6 месяцев.

2.5.2. Для ГЖХ определения

2.5.2.1. Приготовление диазометана.

В круглодонную колбу 1 вместимостью 100 мл, снабженную капельной воронкой с байпасом и обратным холодильником, помещают 12 г (0,2 моля) KOH, 6 мл метилового спирта, 6 мл или 6,1 г (0,12 моля) гидразин-гидрата. Колбу охлаждают до +5 °C смесью воды со льдом и начинают медленно, по каплям прибавлять из капельной воронки 10 мл (0,12 моля) хлороформа, постепенно увеличивая скорость. При этом реакционная масса становится желтой.

Выделяющийся в ходе реакции диазометан через обратный холодильник, соединенный с капилляром стеклянным переходом, поступает в двугорлую колбу-приемник 2, вместимостью 100 мл, содержащую 50 мл осушенного серного эфира. Колба 2 погружена в баню, содержащую смесь воды со льдом.

По окончании прибавления хлороформа реакционную колбу нагревают до 40 °C на водяной бане для полного удаления диазометана из реакционной массы. После обесцвечивания реакционной массы и стенок холодильника реакцию считают законченной. Диазометан хранят в склянке с притертой пробкой в морозильной камере.

2.5.2.2. Подготовка газохроматографической колонки.

Для газохроматографического анализа используют готовый товарный носитель хроматон N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 мм) с 5 % SE-30 и хроматон N-AW-DMSC (0,16 - 0,20 мм) с 5 % OV-17. Хроматографическую колонку заполняют насадкой с подсоединением слабого вакуума. Достаточная плотность набивки обеспечивается равномерной загрузкой и непрерывным постукиванием по колонке. Колонку кондиционируют при скорости азота 30 мл/мин в режиме программирования температуры от 50 до 220 °C со скоростью нагрева 2 °C/мин, а затем в изотермическом режиме при температуре 220 °C в течение 6 - 8 ч без подсоединения колонки к детектору.

Общую подготовку прибора к работе проводят согласно инструкции.

2.5.3. Для ТСХ измерения

2.5.3.1. Приготовление градуировочных растворов.

Градуировочные растворы дикамбы в ацетоне с концентрацией от 10 до 60 мкг/мл готовят соответствующим разбавлением стандартного раствора в пробирках с притертыми пробками вместимостью 5 мл, согласно табл. 2.

Таблица 2

Номер стандарта	Стандартный раствор (100 мкг/мл), мл	Добавлено ацетона, мл	Концентрация дикамбы, мкг/мл	Содержание дикамбы в 0,1 мл хроматографируемой пробы, мкг
1	0,5	4,5	10	1
2	1,0	4,0	20	2
3	1,5	3,5	30	3
4	2,0	3,0	40	4
5	2,5	2,5	50	5
6	3,0	2,0	60	6

Допустимый срок хранения градуировочных растворов при комнатной температуре не более 10 дней.

2.5.3.2. Приготовление проявляющих растворов.

Проявляющий реагент. Растворяют 0,5 г AgNO₃ в 5 мл дистиллированной воды, добавляют 5 мл концентрированного аммиака до растворения осадка и 90 мл ацетона. Хранить в темном месте.

2.5.3.3. Приготовление хроматографической камеры

Хроматографическую камеру за 1 час до начала хроматографирования заливают смесью подвижных растворителей хлороформ-ацетон (3:1) и хлороформ-уксусная кислота (20:1). Объем подвижных растворителей в камере должен по высоте находиться не выше, чем на 0,7 - 1,0 см от дна камеры.

2.6. Подготовка проб к анализу

Зерно размалывают на кофейной мельнице до консистенции манной крупы. Отбирают навеску массой 20 г. Солому и зеленую массу растений измельчают ножом или ножницами и отбирают навески массой 5 г. Почву просеивают через почвенное сито отбирают навески массой 20 г.

2.7. Проведение определения

2.7.1. Экстракция и очистка экстрактов

Зерно. Навеску анализируемой пробы (20 г) помещают в коническую колбу вместимостью 500 мл, добавляют 2 %-й Н₃РO₄, тщательно увлажняют пробу. Дикамбу экстрагируют этиловым эфиром трижды, порциями 100, 80 и 70 мл при помощи механического встряхивания колбы в течение 30 и два раза по 15 мин. Декантируют экстракт через складчатый бумажный фильтр в круглодонную колбу вместимостью 500 мл. Дважды промывают остаток в колбе и фильтр диэтиловым эфиром, порциями по 30 мл.

Объединенный экстракт концентрируют с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 30 - 40 мл. Остаток переносят в делительную воронку вместимостью 150 мл и несколько раз ополаскивают колбу 20 %-м щелочным раствором KCl, общим объемом 20 мл. Промывные воды также переносят в делительную воронку и проводят экстракцию калиевой соли дикамбы путем встряхивания воронки в течение одной - двух минут. После разделения слоев, нижнюю, водную фазу, сливают в другую делительную воронку вместимостью 150 мл. Экстракцию повторяют еще один раз тем же количеством раствора KCl.

Объединенный водный раствор подкисляют серной кислотой, разбавленной водой (1:10), до pH 1 и трижды экстрагируют дикамбу хлороформом, порциями один раз по 30 и два раза по 20 мл. Хлороформный экстракт порциями фильтруют через слой безводного сульфата натрия в грушевидную колбочку вместимостью 50 мл. Каждую порцию фильтрата концентрируют с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 2 - 3 мл. Фильтр со слоем сульфата натрия промывают 5 мл хлороформа. Последнюю порцию сконцентрированного экстракта количественно, хлороформом, переносят в патрон сублиматора. На горячей водяной бане из сублиматора полностью отгоняют растворитель, регулируя равномерное распределение остатка по дну сублиматора. В патрон помещают «палец» сублиматора, подсоединяют холодную воду и вакуум. Сублимацию дикамбы проводят на кипящей водяной бане в течение 30 мин при давлении 0,2 мм рт. ст. После окончания сублимации дикамбу смывают с «пальца» сублиматора в грушевидную колбочку вместимостью 25 мл ацетоном, общим объемом 15 мл. С помощью ротационного вакуумного испарителя из колбочки полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку пипеткой добавляют 0,5 мл гексана, колбочку закрывают пробкой на шлифе и стенки колбы ополаскивают растворителем. Далее определение проводят методом ТСХ по п. 2.7.3.

При определении дикамбы методом ГЖХ по п. 2.7.2 к сухому остатку пипеткой добавляют 2 мл раствора диазометана в диэтиловом эфире. Через 10 - 15 мин диазометан и эфир полностью отдувают слабым током воздуха. К сухому остатку пипеткой добавляют 4 мл гексана. Колбочку закрывают пробкой на шлифе и ее стенки тщательно ополаскивают растворителем.

Солома, зеленая масса растений. Навеску анализируемой пробы массой 5 г помещают в коническую колбу вместимостью 500 мл, добавляют 10 мл 2 %-й Н₃РO₄, тщательно увлажняют пробу и проводят экстракцию дикамбы и получение ее калиевой соли, как описано выше для зерна. Водно-щелочной слой, содержащий калиевую соль дикамбы, трижды промывают гексаном, порциями 2 раза по 20 мл и один раз по 10 мл. Гексановый слой отбрасывают, а к водно-щелочному слою добавляют суспензию 0,5 г активированного угля в 30 мл диэтилового эфира. Колбу интенсивно встряхивают, а затем ее содержимое фильтруют через складчатый бумажный фильтр в делительную воронку. Уголь на фильтре промывают 10 - 15 мл щелочного раствора KCl. После разделения слоев, нижнюю, водную фракцию переносят в другую делительную воронку, а эфирную фракцию отбрасывают. Водный раствор подкисляют до pH 1 разбавленной (1:10) серной кислотой и дальнейшее определение проводят так же, как описано выше для зерна.

Вода. Пробу воды (500 мл) помещают в делительную воронку вместимостью 1 л, добавляют 10 мл 2 %-й Н₃РO₄ и трижды экстрагируют дикамбу из воды хлороформом, порциями по 50 мл. Хлороформные экстракты объединяют в плоскодонной колбе вместимостью 250 мл, сушат над безводным сульфатом натрия (~ 20 г) и порциями декантируют хлороформный раствор в грушевидную колбочку вместимостью 50 мл. Каждую порцию раствора концентрируют с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 1 - 2 мл. Оставшийся в колбе осушитель дважды промывают хлороформом, порциями по 10 мл. Каждую порцию раствора декантируют в грушевидную колбочку и концентрируют. Из последней порции раствора полностью отгоняют растворитель.

Метилирование дикамбы и дальнейшие операции проводят по схеме, описанной выше для зерна.

Определение дикамбы в воде проводят только методом ГЖХ.

Почва. Анализ почвы проводят так же, как анализ зерна.

2.7.2. Определение газожидкостной хроматографией

Из 4 мл подготовленного по п. 2.7.1 экстракта в хроматограф вводят 2 мкл.

Условия хроматографирования:

Колонка 1 Колонка 2

Насадка колонки 5 % SE-30 на 5 % OV-17 на

хроматоне хроматоне

N-AW-DMCS N-AW-DMCS

(0,16 - 0,20 мм) (0,16 - 0,20 мм)

Длина и внутренний диаметр колонки 170 см ´ 3 мм 200 см ´ 3 мм

Рабочая шкала электрометра 64 · 10^-10 мА 64 · 10^-10мА

Скорость протяжки ленты самописца, см/мин 0,25 0,25

Скорость потока газа-носителя азота 30 мл/мин 25 мл/мин

Температура термостата колонки, °C 180 200

Температура испарителя, °C 200 220

Температура, детектора, °C 230 300

Абсолютное время удерживания 3 мин 57 с 4 мин 21с

Объем вводимой пробы, мкл 2 2

Линейный диапазон детектирования 0,05 - 1,0 нг 0,05 - 1,0 нг

Количественное определение проводят методом соотношения со стандартом по высоте пиков.

Серию стандартов готовят следующим образом: в 5 пробирок, вместимостью 5 мл, с пробками на шлифах, пипеткой вносят из стандартного раствора 2 0,1; 0,2; 0,4; 1,0 и 2,0 мл, что соответствует 0,1; 0,2; 0,4; 1,0 и 2,0 мкг дикамбы. Из пробирок на горячей водяной бане или слабым током воздуха полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку пипеткой одновременно с рабочей пробой добавляют по 2 мл раствора диазометана. Через 10 - 15 мин эфир и диазометан отдувают слабым током воздуха. К сухому остатку пипеткой добавляют 4 мл гексана. Пробирку закрывают пробкой на шлифе и ее стенки тщательно обмывают растворителем. Параллельно с рабочей пробой в хроматограф вводят по 2 мкл полученных растворов. Расчет проводят по стандартному раствору, высота пика которого наиболее близка к высоте пика рабочей пробы.

2.7.3. Определение тонкослойной хроматографией

На пластинку силуфол или сорбфил микрошприцем на 100 мкл или микропипеткой с оттянутым концом наносят 100 мкл (0,1 мл) полученного раствора. Справа и слева от рабочей пробы таким же образом наносят серию стандартных растворов дикамбы (1, 2, 3, 4, 5, 6 мкг). Необходимо следить, чтобы диаметр пятна наносимого раствора не превышал 0,5 см.

После высушивания пятен пластинку помещают в хроматографическую камеру, в которую за 30 мин до начала хроматографирования был налит подвижный растворитель. На пластинках силуфол хроматограмму развивают в системе подвижных растворителей хлороформ-уксусная кислота (40:1) или хлороформ-этилацетат-уксусная кислота (15:15:1); на пластинках сорбфил - сначала в системе хлороформ-ацетон (3:1), а затем, после высушивания хроматограммы, в системе хлороформ-уксусная кислота (20:1). После развития хроматограмму высушивают на воздухе, а затем из пульверизатора сначала обрабатывают проявляющим реагентом, а затем помещают под лампу УФ света на 3 мин. Дикамба проявляется на пластинке в виде коричневых пятен на светло-сером фоне с R_f 0,25 ± 0,05. Линейный диапазон определения 1 - 6 мкг. Пятна стабильны в течение одного часа, после чего фон темнеет.

2.8. Обработка результатов анализа

2.8.1. При ГЖХ определении

Содержание дикамбы в анализируемой пробе (X) в мг/кг, мг/л, вычисляют по формуле:

где

С_ст - количество стандарта, введенного в хроматограф, нг;

Н_рп - высота пика рабочей пробы, мм;

Н_ст - высота пика стандарта, мм;

V - общий объем рабочего раствора, мл;

V_a - объем аликвоты, вводимой в хроматограф, мкл;

P - навеска анализируемого образца в г, или объем анализируемой воды в мл.

Если при введении в хроматограф получаются слишком большие пики или происходит зашкаливание, к рабочему раствору пипеткой добавляют замеренное количество гексана и анализируют более разбавленный раствор.

2.8.2. При ТСХ определении

Количественное определение дикамбы в пробе проводят путем сравнения площади и интенсивности окраски пятен рабочей пробы и серии стандартов.

Содержание дикамбы в анализируемой пробе (X) в мг/кг, мг/л вычисляют по формуле:

где

С - количество дикамбы, найденное в хроматографируемой пробе, мкг;

V - общий объем рабочего раствора, мл;

V_a - объем аликвоты, отобранный для хроматографирования, мл;

P - навеска анализируемого образца в г или объем анализируемой воды в мл.

3. Требования безопасности

Соблюдать требования безопасности, принятые для работы с пестицидами, легковоспламеняющимися жидкостями, в частности с диэтиловым эфиром.

Полное отсутствие открытого огня в лаборатории!!!

Соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях, отделениях, отделах санитарно-эпидемиологических учреждений системы МЗ СССР» № 2455-81 от 20.10.81, а также меры предосторожности при работе с ядовитым и взрывоопасным диазометаном.