2. Метод измерений

Методика основана на определении циклоксидима методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после извлечения из образцов воды, почвы, клубней картофеля, семян и масла сои, подсолнечника и рапса, ботвы и корнеплодов сахарной свеклы органическими растворителями, концентрирования и последующих очистках на патронах для твердофазной экстракции (ТФЭ) с привитыми монофункциональными полярными группами С16 и при необходимости дополнительно с гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля.

Идентификация циклоксидима проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки
Весы аналитические с пределом взвешивания до 210 г и пределом допустимой погрешности 0,2 мг	ГОСТ 24104-01
Весы технические с пределом взвешивания до 400 г и допустимой погрешностью 0,1 г	ГОСТ 24104-01
Колбы мерные на 10, 50, 100 и 1000 см³	ГОСТ 23932-90
Пипетки градуированные объёмом 1, 2, 5 и 10 см³	ГОСТ 29227-91
Пробирки мерные со шлифом объёмом 5, 10 см³	ГОСТ 23932-90
Цилиндры мерные на 50 и 100 см³	ГОСТ 23932-90
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Циклоксидим, аналитический стандарт с содержанием основного компонента 99,0 %
Ацетон, осч	ТУ 6-09-3513-86
Ацетонитрил для ВЭЖХ	ТУ 2634-002-04715285-12
Вода бидистиллированная, деионизированная	ГОСТ Р 52501-05
Гексан, хч	ТУ 2631-003-05807999-98
Дихлорметан, хч	ТУ 6-09-2662-77
Изопропиловый спирт, хч	ТУ 2632-015-11291058-95
Кислота ортофосфорная, хч, 0,005 М водный раствор	ГОСТ 6552-80
Метиловый спирт, хч	ГОСТ 6995-77
Натрий сернокислый безводный, хч	ГОСТ 4166-76
Раствор № 1 (гексан-этилацетат в соотношении 2:1)
Раствор № 2 (гексан-этилацетат в соотношении 1:1)
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - 0,005М раствор ортофосфорной кислоты в воде в соотношении 75:25
Этиловый эфир уксусной кислоты, чда	ГОСТ 22300-76
Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18 (150×3,9) мм с зернением 5 мкм
Аппарат для встряхивания проб	ТУ 64-1-1081-73
Воронки химические конусные	ГОСТ 25336-82
Воронки делительные емкостью 100 и 250 см³	ГОСТ 25336-82
Колбы плоскодонные конические вместимостью 100 см³	ГОСТ 25336-82
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10, 50, 100 см³ и 250 мл	ГОСТ 9737-93
Патроны № 1 для ТФЭ с гидрофильным слабокислотным сорбентом с постоянной активностью на основе силикагеля, 0,4 г	ТУ 4215-002-0545-931-94
Патроны № 2 для ТФЭ на основе силикагеля с привитыми монофункциональными полярными группами С16, 0,4 г	ТУ 4215-002-0545-931-94
Предколонка для защиты аналитической колонки, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, (40×3,9) мм с зернением 5 мкм
Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар
Ультразвуковая ванна с рабочей частотой 35 кГц
Фильтры бумажные обезжиренные быстрой фильтрации	ТУ 6.091678-86
Центрифуга с максимальной рабочей частотой вращения 4000 об./мин
Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитическую колонку (150×3,9) мм кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,5 - 1,0 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Кондиционирование патронов для твердофазной экстракции

7.2.1. Патрон № 1 на основе силикагеля с привитыми монофункциональными полярными группами С16 промывают 5 см³ ацетонитрила.

7.2.2. Патрон № 2 с гидрофильным слабокислотным сорбентом с постоянной активностью промывают 2 см³ раствора № 1, затем 3 см³ гексана.

7.3. Подготовка растворителей и приготовление растворов

7.3.1. Подготовка растворителей. Растворители, используемые для анализа, специальной подготовки не требуют. Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. При обнаружении примесей, которые могут мешать определению, растворители очищают общепринятыми методами.

7.3.2. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 ± 0,01) г 98 %-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.3. Раствор № 1 (гексан-этилацетат в соотношении 2:1). В колбу на 500 см³ помещают 200 см³ гексана и добавляют 100 см³ этилацетата.

7.3.4. Раствор № 2 (гексан-этилацетат в соотношении 1:1). В колбу на 500 см³ помещают 200 см³ гексана и добавляют 200 см³ этилацетата.

7.4. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³. Точную навеску циклоксидима (50 ± 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в метаноле и доводят объем до метки метанолом.

Градуировочные растворы с концентрациями циклоксидима 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 и 10,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему.

7.4.2. Раствор № 1 с концентрацией 10,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 2 см³ основного раствора и доводят до метки ацетонитрилом.

7.4.3. Раствор № 2 с концентрацией 5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.4. Раствор № 3 с концентрацией 2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.5. Раствор № 4 с концентрацией 1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.6. Раствор № 5 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора № 2 и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.7. Раствор № 6 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора № 3 и доводят объем до метки ацетонитрилом.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение месяца, градуировочные растворы - в течение недели.

При определении полноты извлечения для внесения в образец следует использовать растворы циклоксидима в ацетонитриле.

7.5. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация циклоксидима в растворе) в хроматограф вводят по 20 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации циклоксидима в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K₁) в уравнении линейной регрессии концентрации раствора С:

С = K₁ × S, где

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

С - аттестованное значение массовой концентрации циклоксидима в градуировочном растворе;

С_к - результат контрольного измерения массовой концентрации циклоксидима в градуировочном растворе;

λ_контр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, %. (λ_контр. = 10 % при Р = 0,95).

7.6. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения производится в соответствии с требованиями технической документации.

7.7. Проверка хроматографического поведения циклоксидима на патронах для ТФЭ

7.7.1. Проверка хроматографического поведения циклоксидима на патроне № 1 для ТФЭ.

На подготовленный патрон № 1 (п. 7.2.1) вносят 1 см³ градуировочного раствора циклоксидима с концентрацией 10 мкг/см³. Элюируют циклоксидим ацетонитрилом со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³ и анализируют по п. 9.3.

Фракции, содержащие циклоксидим, объединяют и вновь анализируют. Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

7.7.2. Проверка хроматографического поведения циклоксидима на патроне № 2 для ТФЭ.

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ градуировочного раствора циклоксидима с концентрацией 10 мкг/см³. Растворитель выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре бани 40 °С. Остаток растворяют в 1 см³ гексана и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2.2). Колбу обмывают 1 см³ гексана и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 3 см³ гексана, элюат отбрасывают. Затем элюируют циклоксидим раствором № 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ ацетонитрила и анализируют по п. 9.3.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб»; ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб»; ГОСТ 1722-85 «Свекла столовая свежая, заготовляемая и поставляемая»; ГОСТ 7194-81 «Картофель свежий. Правила приемки и методы определения качества»; отбор проб семян подсолнечника, рапса и бобов сои для анализа проводят в соответствии с ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб»; ГОСТ 28674-90 «Горох. Требования при заготовке и поставке».

Отобранные пробы хранят до анализа в герметичной полиэтиленовой упаковке в морозильной камере при -18 °С. Пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Пробы картофеля и сахарной свеклы перед анализом, не размораживая, измельчают. Семена рапса, сои, подсолнечника и гороха перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Пробы воды и растительного масла хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в герметично закрытой стеклянной таре не более месяца.

9. Проведение определения

9.1. Экстракция циклоксидима

9.1.1. Вода

В круглодонную колбу на 500 см³ помещают 200 см³ анализируемой воды. Воду выпаривают на вакуумном ротационном испарителе досуха при температуре бани 40 °С. Остаток растворяют в 5 см³ ацетонитрила и хроматографируют по п. 9.3.

9.1.2. Экстракция циклоксидима из почвы, корнеплодов сахарной свеклы, семян рапса, сои, подсолнечника, зерна гороха

Навеску почвы, измельченных проб семян масличных, корнеплодов сахарной свеклы или зерна гороха (10 ± 0,1) г помещают в плоскодонную коническую колбу вместимостью 100 см³, добавляют 30 см³ ацетонитрила, колбу помещают в ультразвуковую ванну на 5 мин или в аппарат для встряхивания на 15 мин. Суспензию центрифугируют 10 мин при 5000 об./мин. Экстракт фильтруют в круглодонную колбу на 250 см³ через бумажный обезжиренный фильтр быстрой фильтрации. Повторяют экстракцию еще 3 раза. Фильтр промывают 10 см³ ацетонитрила. Объединенный экстракт выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре бани 40 °С. Остаток растворяют в 5 - 10 см³ ацетонитрила. Отбирают 1 см³ раствора и проводят очистку на патроне № 1 для ТФЭ (п. 9.2.1.)

9.1.3. Экстракция циклоксидима из растительного масла

Навеску масла (10 ÷ 20 ± 0,1) г помещают в делительную воронку на 100 см³ и экстрагируют 4 раза по 30 см³ ацетонитрилом. Объединенный экстракт упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Остаток растворяют в 10 см³ ацетонитрила. Отбирают 1 см³ раствора и проводят очистку на патроне № 1 для ТФЭ (п. 9.2.1)

9.1.4. Экстракция циклоксидима из ботвы сахарной свеклы, клубней картофеля

Навеску 10 г измельченной пробы помещают в коническую колбу емкостью 100 см³, добавляют 30 см³ раствора гексан-ацетон в соотношении 1:1 и перемешивают на аппарате для встряхивания в течение 15 мин. Суспензию центрифугируют 10 мин при 5000 об./мин. Экстракт фильтруют в круглодонную колбу емкостью 250 см³ методом декантации через бумажный фильтр со слоем безводного сульфата натрия. Фильтр с сульфатом натрия промывают раствором гексан-ацетон три раза по 20 см³. Объединенный экстракт упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Остаток растворяют в 10 см³ ацетонитрила. Отбирают 1 см³ раствора и проводят очистку на патроне № 1 для ТФЭ (п. 9.2).

9.2. Очистка на патронах для ТФЭ

9.2.1. Очистка на патроне № 1: 1 см³ растворенного в ацетонитриле экстракта переносят на подготовленный по п. 7.2.1 патрон № 1. Элюируют циклоксидим 4 см³ ацетонитрила со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Элюат упаривают досуха, растворяют в 1 см³ ацетонитрила и анализируют по п. 9.3.

В случае наличия в контрольных пробах мешающих определению примесей проводят очистку экстракта на патронах № 2 с гидрофильным слабокислотным сорбентом с постоянной активностью на основе силикагеля.

9.2.2. Очистка на патроне № 2: в круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ растворенного в ацетонитриле экстракта. Растворитель выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре бани 40 °С. Остаток растворяют в 1 см³ гексана и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Колбу обмывают 1 см³ гексана и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 3 см³ гексана, элюат отбрасывают. Затем элюируют циклоксидим 5 см³ раствора № 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Элюат упаривают досуха, растворяют в 1 см³ ацетонитрила и анализируют по п. 9.3.

Примечание. Хроматографирование экстрактов ввиду нестабильности циклоксидима рекомендуется проводить сразу после приготовления. Хранение экстрактов подготовленных проб в холодильнике при температуре 0 - 4 °С не более 72 часов.

9.3. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18 (150×3,9) мм с зернением 5 мкм. Предколонка для защиты аналитической колонки, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18 (40×3,9) мм с зернением 5 мкм.

Температура колонки (30 ± 1) °С. Подвижная фаза: ацетонитрил-0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 75:25. Скорость потока элюента: 1,0 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 260 нм. Объем вводимой пробы 20 мм³. Время удерживания циклоксидима (5,1 ± 0,2) мин.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание циклоксидима в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S_x - площадь пика циклоксидима на хроматограмме испытуемого образца, мм² (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения циклоксидима, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств циклоксидима в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор циклоксидима с концентрацией 2,0 мкг/см³, разбавляют ацетонитрилом.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

(1)

X₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (r = 2,8σ_r).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(X ± ∆) мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

∆ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,2 мг/кг*, где

________

* - 0,2 мг/кг - предел обнаружения циклоксидима в зерне гороха).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки С_д, должна удовлетворять условию:

С_д = ∆_л,Х + ∆_л,Х’, где

±∆_л,Х (±∆_л,Х’) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

∆_л = ±0,84∆, где

∆ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

К_к = X' - X - С_д, где

X', X, С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

(1)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

ǀК_кǀ ≤ К,

(2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):