Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
флоникамида в воде, почве, яблоках
и яблочном соке методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.3135-13

1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийский НИИ защиты растений Россельхозакадемии (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, А.С. Комарова, Т.Д. Черменская, В.В. Человечкова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 29 октября 2013 г. № 3).

3. Утверждены врио руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю. Поповой 12 ноября 2013 г.

4. Введены впервые.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств флоникамида
в воде, почве, яблоках и яблочном соке методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.143/01.00043/2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации флоникамида в воде в диапазоне концентраций 0,001 - 0,01 мг/дм³, в почве в диапазоне концентраций 0,02 - 0,2 мг/кг, яблоках и яблочном соке в диапазоне концентраций 0,05 - 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: флоникамид.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 4-трифторметил-N-цианометилникотинамид.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₉H₆F₃N₃O.

Молекулярная масса: 229,2.

Химически чистое вещество представляет собой белый кристаллический порошок без запаха.

Температура плавления: 157,5 °С.

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_owlgP = 0,3.

Растворимость в воде (г/дм³, 20 °С) - 5,2.

Растворимость в органических растворителях (г/дм³, 20 °С): ацетон - 163,5, толуол - 0,55, этилацетат - 34,2, дихлорметан - 4,5.

Краткая токсикологическая характеристика: острая пероральная ЛД₅₀ = 884; 1 768 мг/кг массы тела для самцов и самок крыс соответственно. Острая дермальная для крыс ЛД₅₀ > 5 000 мг/кг. Не ирритант для кожи и глаз кроликов. Острая токсичность: рыбы ЛК₅₀ > 100 мг/л, дафнии ЭК₅₀ > 100 мг/л, зеленые водоросли ЭК₅₀ > 100 мг/л. Не токсичен для энтомофагов.

Область применения: селективный, системный инсектицид для сосущих насекомых, повреждающих плодовые, зерновые, овощные культуры.

В России для флоникамида гигиенические нормативы не установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Таблица 2

Полнота извлечения флоникамида, стандартнее отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, Р = 0,95

2. Метод измерений

Методика основана на определении флоникамида методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после его извлечения из образцов органическим растворителем и последующей очистки на патронах для твердофазной экстракции.

Идентификация флоникамида проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

3.2. Реактивы

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Кондиционирование патрона для твердофазной экстракции

Патрон промывают 2 см³ этилацетата, затем 3 см³ смеси № 1 (гексан꞉этилацетат).

7.3. Приготовление растворов

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 ±0,01) г 98 %-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Для приготовления 0,1 М фосфатного буфера взвешивают 11,4 г калия фосфорно-кислого двузамещенного 3-водного и 6,8 г калия дигидрофосфата, переносят в мерную колбу вместимостью 1 000 см³, растворяют в воде и доводят объем до метки водой.

7.3.3. Смесь ацетонитрила с водой в соотношении 20꞉80 готовят по объёму, используя мерные цилиндры.

7.3.4. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 13꞉87 по объёму, используя мерные цилиндры.

7.4. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску флоникамида (50 ± 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.2. Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями флоникамида 0,1, 0,5, 1,0, 5,0 и 10,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя смесь ацетонитрила и воды в соотношении 20꞉80.

7.4.2.1. Раствор № 1 с концентрацией 10,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 2,0 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.2. Раствор № 2 с концентрацией 5,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1,0 см³ основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.3. Раствор № 3 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора № 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.5. Раствор № 5 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора № 3 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - 2 дней.

При изучении полноты определения флоникамида в воде, почве, яблоках и яблочном соке используют ацетоновые растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетоном.

7.5. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация флоникамида в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации флоникамида в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

С = KS, где

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

C - аттестованное значение массовой концентрации флоникамида в градуировочном растворе,

C_к - результат контрольного измерения массовой концентрации флоникамида в градуировочном растворе,

λ_контр - норматив контроля градуировочного коэффициента, % (λ_контр = 10 % при Р = 0,95).

7.6. Проверка хроматографического поведения флоникамида на патроне

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора флоникамида с концентрацией 1 мкг/см³. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см³ смеси № 1 и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Колбу обмывают 1 см³ смеси № 1 и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 5 см³ смеси № 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют флоникамид этилацетатом со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ смеси ацетонитрил-вода, 20꞉80 и анализируют по п. 9.4.

Фракции, содержащие флоникамид, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание: Проверку хроматографического поведения флоникамида следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб»; ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб». Отбор проб яблок производят в соответствии с ГОСТ 27572-87 «Яблоки свежие для промышленной переработки».

Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Пробы фруктов хранят до анализа в герметичной полиэтиленовой упаковке в морозильной камере при -18 °С. Перед анализом фрукты, не размораживая, измельчают на терке или в гомогенизаторе.

9. Проведение определения

9.1. Экстракция флоникамида из воды

Пробу воды 100 см³ помещают в делительную воронку вместимостью 250 см³, добавляют 30 см³ этилацетата и интенсивно встряхивают 2 - 3 мин. После полного разделения фаз верхний органический слой собирают, к водному добавляют 30 см³ этилацетата и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции пропускают через воронку, содержащую безводный сульфат натрия, и собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ смеси ацетонитрил - вода 20꞉80, и 10 мм³ вводят в хроматограф.

9.2. Экстракция флоникамида из почвы

Навеску почвы 20 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³ и добавляют 20 см³ ацетона. Пробирку плотно закрывают и помещают в аппарат для встряхивания на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. От верхнего слоя отбирают аликвоту 10 см³, соответствующую 10 г пробы, переносят в круглодонную колбу вместимостью 50 см. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С, остаток растворяют в 1 см³ смеси ацетонитрил-вода 20꞉80 и 10 мм³ вводят в хроматограф.

9.3. Экстракция флоникамида из яблок

Навеску измельченных плодов яблок 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 100 см³, добавляют 30 см³ 0,1 М фосфатного буфера и колбу помещают в ультразвуковую ванну на 10 мин. Экстракт декантируют в делительную воронку вместимостью 250 см³ пропуская через бумажный фильтр, к остатку в колбе добавляют 30 см³ буфера и повторяют экстракцию. К объединенному экстракту в делительной воронке добавляют 30 см³ этилацетата и интенсивно встряхивают 2 - 3 мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 см³ этил ацетата и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции пропускают через воронку, содержащую безводный сульфат натрия, собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см³ и растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.5.

9.4. Экстракция флоникамида из яблочного сока

Навеску сока 20 г помещают в стакан вместимостью 100 см³, доводят объем до 50 см³ 0,1 М фосфатным буфером и переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³, добавляют 30 см³ этилацетата и интенсивно встряхивают 2 - 3 мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 см³ этилацетата и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции пропускают через воронку, содержащую безводный сульфат натрия, собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см³ и растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.5.

9.5. Очистка на патроне для твердофазной экстракции

Сухой остаток, полученный по п. 9.3 или 9.4, растворяют в 1 см³ смеси № 1, наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 7.2), колбу ополаскивают 1 см³ смеси № 1 и также наносят на патрон. Патрон промывают 5 см³ смеси № 1, элюат отбрасывают. Флоникамид элюируют 6 см³ этилацетата, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в 1 см³ смеси ацетонитрил-вода 20꞉80 и 10 мм³ вводят в хроматограф.

9.6. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостной хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18 - (2,1×100) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 + 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 13꞉87. Скорость потока элюента: 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны ультрафиолетового детектора 265 нм. Объем вводимой пробы 10 мм³.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание флоникамида в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S_x - площадь пика флоникамида на хроматограмме испытуемого образца, мм² (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения флоникамида, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств флоникамида в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор флоникамида с концентрацией 10,0 мкг/см³, разбавляют смесью ацетонитрил-вода в соотношении 20꞉80.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (r = 2,8σ_r).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,05 мг/кг^*, где ^* - 0,05 мг/кг - предел обнаружения флоникамида в яблоках).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

C_д = Δ_л,X + Δ_л,X', где

±Δ_л,X (±Δ_л,X') - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

Δ_л = ±0,84Δ, где

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры K_к рассчитывают по формуле:

K_к = X' - X - C_д, где

X', X, C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_к) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Содержание