4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
пикоксистробина в зеленой массе, зерне и
масле кукурузы, в семенах и масле
подсолнечника, рапса и сои методом
высокоэффективной жидкостной
хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.3095-13

Москва • 2013

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России (В.А. Калинин, Е.В. Довгилевич, А.В. Довгилевич, Б.Н. Щербинкина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. № 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31 июля 2013 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств пикоксистробина
в зеленой массе, зерне и масле кукурузы, в семенах и
масле подсолнечника, рапса и сои методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.3095-13

Свидетельство о метрологической аттестации от 4 октября 2012 г. № 01.00282-2008/0134.04.10.12.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств в зеленой массе кукурузы в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг, в зерне и масле кукурузы, а также в семенах и масле подсолнечника, рапса и сои в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: пикоксистробин.

Название действующего вещества по ИЮПАК: метил (Е)-3-метокси-2-[2-(6-трифторметил-2-пиридилоксиметил) фенил]акрилат.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₈H₁₆F₃NO₄.

Молекулярная масса: 367,3.

Агрегатное состояние: порошок.

Цвет, запах: от белого до светло-бежевого цвета, без запаха.

Давление паров: 5,5×10^-3 мПа (при 20 °С).

Коэффициент распределения октанол-вода (20 °С): K_ow logP = 3,6.

Температура плавления: 75 °С.

Растворимость в воде мг/дм³ (20 °С): 3,1.

Растворимость в органических растворителях (г/дм³, 20 °С): метанол - 96; 1,2-дихлорэтан, ацетон, ксилол, этилацетат - более 250.

Устойчив к гидролизу в диапазоне рН 5 - 7.

Краткая токсикологическая характеристика

Пикоксистробин относится к веществам малоопасным по острой пероральной (ЛД₅₀ для крыс более 5000 мг/кг) и дермальной токсичности (ЛД₅₀ для крыс 2120 мг/кг), но к умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК₅₀ для крыс (4 ч) более 2000 мг/м³). Не вызывает покраснения кожных покровов и глаз кроликов. Не обладает генотоксическим, канцерогенным и тератогенным свойствами.

Область применения

Пикоксистробин - фунгицид защитного, ограниченно системного действия, применяется для борьбы с широким спектром заболеваний, вызываемых ложномучнисторосяными и мучнисто-росяными грибами.

Предлагается в России в качестве фунгицида в посевах зерновых колосовых культур при норме расхода 120 г д.в./га.

В России для пикоксистробина установлены следующие гигиенические нормативы: ДСД - 0,04 мг/кг массы тела человека; ОБУВ в атмосферном воздухе - 0,01 мг/м³; ОДК в почве - 0,4 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,03 мг/дм³; МДУ в зерне хлебных злаков - 0,2 мг/кг, в корнеплодах сахарной свеклы - 0,05 мг/кг.

МДУ в импортируемой продукции (мг/кг): семена масличных - 0,05.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих Диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 1

Метрологические параметры для пикоксистробина

Таблица 2

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для пикоксистробина

2. Метод измерений

Метод основан на определении пикоксистробина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового диодно-матричного детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, на колонках с окисью алюминия, на концентрирующих патронах № 1 и 2.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-91.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

· процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С, относительной влажности не более 80 % и нормальном атмосферном давлении;

· выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению определений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с окисью алюминия, концентрирующих патронов № 1 и 2 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонках с окисью алюминия и на концентрирующих патронах № 1 и 2, установление градуировочной характеристики.

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °С, отбрасывают.

7.1.2. Приготовление бидистиллированной воды

Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм³ и кипятят в течение 6 ч.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °С, отбрасывают.

7.2. Приготовление растворов для проведения анализа

7.2.1. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.

В плоскодонную колбу объемом 1000 см³ помещают 600 см³ ацетонитрила и 400 см³ очищенной воды. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 см³/мин в течение 5 мин, после чего на 1 мин помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов. Готовый раствор подвижной фазы хранят при комнатной температуре не более 7 суток.

7.2.2. Приготовление градуировочных растворов

7.2.2.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией пикоксистробина 1,0 мг/см³.

Взвешивают 50 мг пикоксистробина в мерной колбе объемом 50 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 1 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.

7.2.2.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией пикоксистробина 10,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 2 используется для внесения в контрольные образцы и для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 2 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией пикоксистробина 1,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 3 используется для установления градуировочной характеристики и для внесения в контрольные образцы. Стандартный раствор № 3 хранится в холодильнике не более 15 суток.

7.2.2.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией пикоксистробина 0,5 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор №4 используется для установления градуировочной характеристики и для внесения в контрольные образцы. Стандартный раствор № 4 хранится в холодильнике не более 15 суток.

7.2.2.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией пикоксистробина 0,2 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 50 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 5 используется для установления градуировочной характеристики и для внесения в контрольные образцы. Стандартный раствор № 5 хранится в холодильнике не более 15 суток.

7.2.2.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией пикоксистробина 0,1 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 6 используется для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 6 хранится в холодильнике не более 15 суток.

7.2.2.7. Стандартные растворы с концентрацией пикоксистробина 2,5; 2,0; 1,0; 0,5; 0,4; 0,25 и 0,2 мкг/см³ для внесения в контрольные образцы.

Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 2,5; 2,0; 1,0; 0,5; 0,4; 0,25 и 0,2 мкг/см³ и используют эти растворы с целью внесения в контрольные образцы. Стандартные растворы для внесения в контрольные образцы хранятся в холодильнике не более 30 суток.

Методом последовательного разведения ацетоном готовят растворы, содержащие по 2,0; 1,0; 0,4 и 0,2 мкг/см³ и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы масла. Стандартные растворы для внесения в контрольные образцы хранятся в холодильнике не более 30 суток.

7.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации пикоксистробина в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см³.

В инжектор хроматографа вводят по 10 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.6. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

7.4. Подготовка колонки с окисью алюминия для очистки экстракта и проверка хроматографического поведения пикоксистробина на ней

7.4.1. Подготовка колонки с окисью алюминия для очистки экстракта

В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 3 г окиси алюминия с зернением 40/250 меш. и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. Непосредственно перед использованием колонку промывают 10 см³ ацетонитрила.

7.4.2. Проверка хроматографического поведения пикоксистробина на колонке с окисью алюминия

В концентратор объемом 100 см³ вносят 1 см³ стандартного раствора пикоксистробина в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см³ и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 10 см³ ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и наносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Исходную колбу обмывают еще двумя порциями ацетонитрила объемом по 10 см³ каждая и последовательно вносят их на колонку. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы объемом по 100 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие пикоксистробин, полноту смывания с колонки и необходимый объём элюента.

Изучение поведения пикоксистробина на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии окиси алюминия.

7.5. Подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки экстракта и проверка хроматографического поведения пикоксистробина на них

7.5.1 Подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин (1 - 2 кап./с).

Патрон № 1 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц объемом не менее 10 см³ (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 10 см³ смеси ацетона с гексаном в соотношении 1:9, затем 10 см³ гексана. Элюаты отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.5.2. Проверка хроматографического поведения пикоксистробина на патроне № 1

В концентратор объемом 100 см³ вносят 1 см³ стандартного раствора Пикоксистробина в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см³ и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетона, добавляют 9 см³ гексана, тщательно обмывают стенки концентратора и наносят раствор на патрон. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Исходную колбу обмывают еще двумя порциями смеси ацетона с гексаном в соотношении 1:9 объемом по 10 см³ каждая и последовательно вносят их на патрон. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы объемом по 100 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие пикоксистробин, полноту смывания с патрона и необходимый объём элюента.

Изучение поведения пикоксистробина на концентрирующих патронах № 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.

7.6. Подготовка концентрирующих патронов № 2 для очистки экстракта и проверка хроматографического поведения пикоксистробина на них

7.6.1. Подготовка концентрирующих патронов № 2 для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин (1 - 2 кап./с).

Патрон № 2 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц объемом не менее 10 см³ (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 2:1, затем 20 см³ воды. Элюаты отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.6.2. Проверка хроматографического поведения пикоксистробина на концентрирующих патронах № 2

Из стандартного раствора пикоксистробина в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/см³, отбирают 1 см³, помещают в концентратор объемом 100 см³ и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 см³ воды, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.

Исходный концентратор обмывают последовательно 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:4, затем 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:2, затем тремя порциями по 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 2:1, полученные растворы последовательно вносят на патрон. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие пикоксистробин, полноту смывания с патрона и необходимый объём элюента.

Изучение поведения пикоксистробина на концентрирующих патронах № 2 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.

7.7. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии

Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °С и скорости потока подвижной фазы 0,25 см³/мин 3 - 4 ч.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» № 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ 13586.3-83 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб», ГОСТ Р ИСО 6497-2011 «Корма растительного происхождения. Методы отбора проб», ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб», ГОСТ 17109-88 «Соя. Требования при заготовках и поставках», ГОСТ Р 53510-2009 «Масло соевое. ТУ», ГОСТ 8808-2000 «Масло кукурузное. ТУ», ГОСТ 22391-89 «Подсолнечник. Требования при заготовках и поставках», ГОСТ Р 52465-2005 «Масло подсолнечное. ТУ», ГОСТ Р 53457-2009 «Масло рапсовое. ТУ», ГОСТ Р 52062-2003 «Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб».

Пробы зеленой массы кукурузы хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 - 4 °С не более суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре -18 °С до 2 лет.

Отобранные пробы зерна кукурузы, а также семян сои, подсолнечника и рапса подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.

Пробы кукурузного, соевого, подсолнечного и рапсового масла хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °С не более 10 суток.

9. Выполнение определения

9.1. Зеленая масса кукурузы

9.1.1. Экстракция

Образец измельченной зеленой массы кукурузы массой 5 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, прибавляют 70 см³ ацетонитрила и помещают на 5 мин в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 см³ через фильтр средней плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 см³ ацетонитрила и помещая на 5 мин в ультразвуковую ванну. Экстракты объединяют в концентраторе объемом 250 см³ и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К сухому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.1.1, прибавляют 5 см³ ацетонитрила, обмывают стенки концентратора, затем прибавляют 100 см³ дистиллированной воды, 5 г хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 см³. Пикоксистробин экстрагируют тремя порциями гексана объемом по 30 см³, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) собирают через слой безводного сульфата натрия в коническую колбу объемом 100 см³.

Гексан переносят в сухую делительную воронку объемом 250 см³ и экстрагируют пикоксистробин тремя порциями ацетонитрила объемом по 30 см³, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 мин. После полного разделения фаз слой собирают в концентратор объемом 250 см³ через слой безводного сульфата натрия и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

9.1.3. Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия

Сухой остаток, полученный в п. 9.1.2, растворяют в 10 см³ ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора, наносят на подготовленную колонку, элюат собирают в концентратор. Исходную колбу обмывают 10 см³ ацетонитрила и вносят на колонку. Элюаты объединяют и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток подвергают дальнейшей очистке на концентрирующих патронах № 1 и 2.

9.1.4. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 2

Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 см³ воды, перемешивают и вносят на подготовленный патрон. Элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают последовательно 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:4, затем 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:2. Растворы наносят на патрон и элюаты также отбрасывают. Пикоксистробин элюируют 20 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 2:1. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.5. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1

Сухой остаток в концентраторе растворяют в 1 см³ ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 см³ гексана, перемешивают и вносят на подготовленный патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см³. Исходную колбу обмывают 10 см³ смеси ацетона с гексаном в соотношении 1:9 и вносят на патрон. Элюаты объединяют в концентраторе и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 2,5 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.2. Зерно кукурузы, семена сои и рапса

9.2.1. Экстракция

Образец измельченного зерна кукурузы (семян сои или рапса) массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, прибавляют 40 см³ ацетонитрила и помещают на 5 мин в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 см³ через фильтр средней плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 40 см³ ацетонитрила и помещая на 5 мин в ультразвуковую ванну. Экстракты фильтруют, объединяют в концентраторе объемом 250 см³ и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, п. 9.1.3. Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия и п. 9.1.4. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 2.

Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.3. Семена подсолнечника

9.3.1. Экстракция

Образец измельченных семян подсолнечника массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, прибавляют 70 см³ ацетонитрила и помещают на 5 мин в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 см³ через фильтр средней плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 см³ ацетонитрила и помещая на 5 мин в ультразвуковую ванну. Экстракты фильтруют, объединяют в концентраторе объемом 250 см³ и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, п. 9.1.3. Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия и п. 9.1.4. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 2.

Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.4. Масло подсолнечника, кукурузы и сои

9.4.1. Экстракция

Из пробы подсолнечного (кукурузного или соевого) масла отбирают в стакан навеску массой 10 г и переносят ее в делительную воронку объемом 250 см³ тремя порциями гексана объемом по 30 см³. Пикоксистробин экстрагируют тремя порциями ацетонитрила объемом по 30 см³, встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор объемом 250 см³ и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С. Верхний слой (гексан) отбрасывают.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, п. 9.1.3. Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия и п. 9.1.4. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 2.

Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.5. Масло рапса

9.5.1. Экстракция

Из пробы рапсового масла отбирают в стакан навеску массой 10 г и переносят ее в делительную воронку объемом 250 см³ двумя порциями гексана объемом по 25 см³. Пикоксистробин экстрагируют тремя порциями ацетонитрила объемом по 50 см³, встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор объемом 250 см³ и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С. Верхний слой (гексан) отбрасывают.

9.5.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К сухому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.5.1, прибавляют 5 см³ ацетонитрила, обмывают стенки концентратора, затем прибавляют 100 см³ дистиллированной воды, 5 г хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 см³. Пикоксистробин экстрагируют тремя порциями гексана объемом по 30 см³, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 см³ и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.3. Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия, п. 9.1.4. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 2 и по п. 9.1.5. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1.

Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.6. Условия хроматографирования.

Хроматографическая система, включающая:

- хроматограф жидкостной с диодно-матричным детектором, снабженный термостатом доя колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °С и стандартным автосамплером с дозирующим объемом от 0,1 до 100 мм³ для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему;

- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.

Колонка хроматографическая стальная, длиной 150 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 3,5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С18.

Предколонка хроматографическая стальная, длиной 12,5 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С8.

Температура колонки: 30 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода в соотношении 60:40.

Длина волны: 250 нм.

Время удерживания пикоксистробина: 6,786 мин ± 3 %.

Чувствительность не менее 12 mAU (миллиединиц абсорбции) на шкалу.

Объем вводимой пробы: 10 мм³.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

10. Обработка результатов.

Содержание пикоксистробина в пробах рассчитывают по формуле:

 где

X - содержание пикоксистробина в пробе, мг/кг;

S_ст - высота (площадь) пика стандарта, мм;

S_np - высота (площадь) пика образца, мм;

А - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г (см³);

Р - содержание пикоксистробина в аналитическом стандарте, %.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

 где                                  (1)

Х₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8×σ_r.

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

 где

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее 0,02 мг/кг»^*

___________

^* - 0,02 мг/кг - предел обнаружения.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Контроль стабильности градуировочной характеристики для пикоксистробина проводят при смене основного градуировочного раствора № 1 каждые 6 месяцев, при смене основного градуировочного раствора № 2 - каждый месяц, при смене основных градуировочных растворов № 3, 4, 5 и 6 - каждые 15 суток, а также в начале и окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание пикоксистробина в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

 где

Х - концентрация пикоксистробина контрольного измерения, мкг/см³;

С - известная концентрация градуировочного раствора пикоксистробина в смеси ацетонитрила с водой, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

2,96 - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (А) превышает 2,96 %, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов пикоксистробина, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 7.3.

13.2 Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

 где

±  - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

Δ_л = ±0,84Δ, где

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

 где

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

 где

, , С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

                                                                      (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

 где                                       (3)

Х₁, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Приложение 1

Полнота извлечения пикоксистробина из воды, почвы, зерна и соломы зерновых культур (5 повторностей для каждой концентрации, Р = 0,95)