4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение концентраций действующих
веществ пестицидов в воде, почве, зеленой
массе, зерне и соломе зерновых культур,
семенах и масле рапса, зерне гороха,
семенах и масле льна

Сборник методических указаний
по методам контроля
МУК 4.1.3020-12; 4.1.3022-12;
4.1.3042-12; 4.1.3045-12

Москва 2013

1. Разработаны сотрудниками ГНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» Россельхозакадемии, ФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологии им. Д.И. Менделеева».

2. Введены в действие с момента утверждения.

3. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение остаточных количеств имазалила
в зерне гороха методом капиллярной
газожидкостной хроматографии

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.083/01.00043/2012.

Настоящие методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения в зерне гороха массовой концентрации имазалила в диапазоне концентраций 0,02 - 0,2 мг/кг.

Название действующего вещества по ИСО: имазалил.

Название действующего вещества по ИЮПАК: (±)-1-(β-аллилокси-2,4-дихлорфенилэтил) имидазол.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₄H₁₄Cl₂N₂O.

Молекулярная масса: 297,2.

Химически чистый имазалил представляет собой кристаллическую массу от светло-желтого до коричневого цвета с температурой плавления 52,7 °С, давлением паров 0,158 мРа (20 °С).

Коэффициент распределения в системе н-окганол-вода K_ow log P = 3,82 (рН 9,2 буфер).

Растворимость при 20 °С (г/л): в воде - 0,18 (рН 7,6, 20 °С), в гексане - 19 г/л, ацетоне, дихлорметане, этаноле, метаноле, изопропаноле, бензоле, толуоле, ксилоле - более 500 г/л, растворим в гептане, петролейном эфире.

Стабилен к гидролизу в разбавленных кислотах и щелочах при комнатной температуре в отсутствие света. Стабилен к свету при нормальных условиях хранения. Стабилен при нагревании до 285 °С. В почве DT₅₀ 4 - 5 дней, DT₉₀ 54 - 68 дней.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность для крыс LD₅₀ 227 - 343 мг/кг. Дермальная токсичность для крыс LD₅₀ 4200 - 4880 мг/кг. Класс токсичности по ВОЗ и ЕРА - II.

Область применения

Системный фунгицид с защитным и лечебным действием.

Гигиенические нормативы: МДУ в семенах подсолнечника, сои и рапса 0,02 мг/кг, в горохе не установлен.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Таблица 2

Полнота извлечения имазалила, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для п = 20, Р = 0,95

2. Метод измерений

Методика основана на определении имазалила методом капиллярной ГЖХ с использованием термоионного детектора после его извлечения из образцов гороха органическими растворителями с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися жидкими фазами и на колонке с силикагелем.

Идентификация имазалила проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования иных производителей с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.007-76).

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-2009 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 мПа (150 кгс/см²) необходимо соблюдать «Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздуховодов и газопроводов под давлением» ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом капиллярной газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 12.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

·     процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

·     выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Отбор и хранение проб

Отбор проб зерна гороха проводят в соответствии с ГОСТ 28674-90 «Горох. Требования по заготовке и поставке». Для длительного хранения аналитические пробы зерна гороха помещают в герметично закрытый двойной полиэтиленовый пакет и хранят в морозильной камере с температурой -18 °С.

8. Подготовка к определению

8.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С до объема 1 см³ и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

8.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа капиллярную колонку, не присоединяя к детектору, кондиционируют в токе инертного газа (азот) при температуре 250 °С до получения стабильной нулевой линии.

8.3. Приготовление растворов для очистки экстрактов

8.3.1. Элюент № 2 для колоночной хроматографии: в мерной колбе объемом 100 см³ смешивают 95 см³ н-гексана и 5 см³ ацетона.

8.3.2. Элюента № 3 для колоночной хроматографии: в мерной колбе объемом 100 см³ смешивают 80 см³ н-гексана и 20 см³ ацетона.

8.4. Приготовление градуировочных растворов

8.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску имазалила (50 ± 0,1) мг помещают в мерную колбу на 100 см³, растворяют в ацетоне и доводят до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы с концентрациями 0,2, 0,5, 1,0, 2,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления основного раствора по объему, используя ацетон.

8.4.2. Раствор № 1 с концентрацией имазалила 2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,4 см³ основного раствора и доводят объем до метки ацетоном.

8.4.3. Раствор № 2 с концентрацией имазалила 1 мкг/см³: в мерную пробирку вместимостью 10 см³ вносят 5 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки ацетоном.

8.4.4. Раствор № 3 с концентрацией имазалила 0,5 мкг/см³: в мерную пробирку вместимостью 10 см³ вносят 5 см³ раствора № 2 и доводят объем до метки ацетоном.

8.4.5. Раствор № 4 с концентрацией имазалила 0,2 мкг/см³: в мерную пробирку вместимостью 10 см³ вносят 4 см³ раствора № 3 и доводят объем до метки ацетоном.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 6 месяцев, градуировочные растворы - в течение 2 недель.

Для определения полноты извлечения имазалила из образцов гороха используют градуировочные растворы в ацетоне.

8.5. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация имазалила в растворе) в хроматограф вводят по 1 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика (мв ∙ с) от концентрации имазалила в градуировочном растворе (мкг/см³).

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

С = KS, где

S - площадь пика в градуировочном растворе.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

С - аттестованное значение массовой концентрации имазалила в градуировочном растворе;

С_к - результат контрольного измерения массовой концентрации имазалила в градуировочном растворе;

λ_контр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, % (λ_контр. = 10 % при Р = 0,95).

8.6. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

Силикагель не менее 5 ч прокаливают при 130 °С, охлаждают и хранят в эксикаторе. Навеску силикагеля 98,5 г помещают в круглодонную колбу и добавляют 1,5 г дистиллированной воды. Колбу плотно закрывают и интенсивно встряхивают в течение 5 мин. Затем колбу присоединяют к ротационному испарителю при атмосферном давлении и медленно вращают 2 ч. Деактивированный таким образом силикагель используют в течение 5 дней.

На дно стеклянной колонки помещают тампон из стекловаты, слой 0,5 см безводного сульфата натрия и заполняют суспензией 2 г силикагеля в 5 см³ гексана при открытом кране, сверху вносят слой 0,5 см безводного сульфата натрия и промывают колонку 10 см³ гексана. Когда уровень растворителя достигнет верхнего слоя в колонке, кран закрывают. Колонка готова к работе.

8.7. Проверка хроматографического поведения имазалила на колонке с силикагелем

На роторном испарителе при температуре не выше 40 °С упаривают досуха 5 см³ градуировочного раствора с известной концентрацией имазалила.

В колбу с сухим остатком вносят 2 см³ элюента № 1 и помещают колбу в ультразвуковую ванну на 5 мин. Затем пипеткой переносят раствор на колонку. Открывают кран и дают раствору впитаться. Когда уровень растворителя достигнет верхнего края колонки, кран закрывают. Колбу дважды ополаскивают 2 см³ элюента № 1 и пипеткой переносят раствор на колонку. Начинают элюирование в градуированную пробирку с притертой пробкой на 10 см³. После завершения пробирку закрывают и встряхивают. Таким образом, получена фракция с элюентом № 1.

Ту же колбу, где был сухой остаток, ополаскивают 2 см³ элюента № 2 и помещают колбу в ультразвуковую ванну на 5 мин. Затем пипеткой переносят раствор на колонку, колбу ополаскивают 2 см³ элюента № 2 и переносят на колонку. Таким образом, получена фракция с элюентом № 2.

Эту процедуру повторяют с элюентами № 3 и № 4 и, таким образом, готовят фракции с соответствующими элюентами.

Элюаты упаривают, сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетона и хроматографируют. Фракции, содержащие имазалил, объединяют, упаривают, сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетона и хроматографируют. Рассчитывают содержание имазалила в суммарном элюате, определяя полноту извлечения из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание. Профиль вымывания имазалила может изменяться при использовании силикагеля другой партии или марки.

8.8. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

9. Проведение определения

9.1. Экстракция имазалила из зерна гороха

Навеску зерна гороха массой (10 ± 0,1) г размолотого на лабораторной мельнице помещают в коническую колбу объемом 300 см³, добавляют 50 см³ теплой дистиллированной воды и оставляют на 30 мин для набухания. Затем добавляют 50 см³ ацетона и экстрагируют имазалил в ультразвуковой ванне в течение 5 мин.

Экстракт фильтруют через складчатый фильтр «белая лента» на воронке Бюхнера в коническую колбу на 300 см³. Экстракцию повторяют дважды по 50 см³ ацетона.

Объединенный экстракт помещают в морозильную камеру с температурой 18 °С на 2 - 3 ч. После этого экстракт фильтруют через бумажный фильтр «красная лента» в колбу-концентратор на 500 см³, фильтр и колбу ополаскивают 10 см³ охлажденного ацетона. Водно-ацетоновый экстракт упаривают до водного остатка при температуре не выше 40 °С на роторном испарителе. Водный остаток переносят в делительную воронку на 250 см³, добавляют 10 см³ насыщенного раствора хлористого натрия и 50 см³ дихлорметана, встряхивают в течение 2 мин и оставляют до полного расслоения. После разделения фаз дихлорметановый слой фильтруют в колбу-концентратор через слой безводного сернокислого натрия, а водный слой возвращают в делительную воронку и повторяют экстракцию еще 2 - 3 раза порциями дихлорметана по 30 см³.

Объединенный фильтрат упаривают на ротационном испарителе до объема 2 см³ при температуре не выше 40 °С. Остатки растворителя удаляют в токе азота. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетона и хроматографируют. При наличии мешающих примесей дополнительную очистку проводят на колонке с силикагелем по п. 9.2.

9.2. Очистка экстрактов на колонке с силикагелем

В колбу с сухим остатком вносят 2 см³ элюента № 1 и растворяют его в ультразвуковой ванне в течение 5 мин. Пипеткой полностью переносят раствор на колонку. Открывают кран и дают пробе впитаться. Когда уровень растворителя достигнет верхнего края колонки, кран закрывают. Колбу ополаскивают 2 см³ элюента № 1, пипеткой переносят раствор на колонку и открывают кран. Элюат отбрасывают.

Продолжают элюирование, как описано в п. 8.7 элюентами № 2 и № 3. Элюаты отбрасывают.

Продолжают элюирование элюентом № 4. Собранную фракцию упаривают, сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетона и хроматографируют.

9.3. Условия хроматографирования

Газовый хроматограф «Кристалл 2000 М» с ТИД, колонка кварцевая капиллярная длиной 30 м, диаметром 0,25 мм, неподвижная фаза НР-1, толщина слоя 0,25 мкм. Температура колонки программируется от 150 °С (15 с) до 240 °С со скоростью 15 °С/мин. Температура термостата детектора 350 °С, испарителя 240 °С. Расход газа-носителя 1 (азот) - 1,7 см³/мин (деление потока 1:2,8), водорода - 14,4 см³/мин, воздуха - 200 см³/мин. Расход газа 3 (азот) - 10 см³/мин. Дозируемый объем - 2 мм³. Анализируемый объем - 1 см³. Время удерживания имазалила - 6 мин (54 ± 5) с.

9.4. Обработка результатов анализа

Содержание имазалила в пробе рассчитывают методом внешнего стандарта по формуле:

 где

X - массовая концентрация имазалила в пробе, мг/кг;

H - высота (площадь) пика анализируемого вещества, мм (мв ∙ с);

Н_ст - высота (площадь) пика аналитического стандарта, мм (мв ∙ с);

А - концентрация градуировочного раствора имазалила, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

т - навеска аналитической пробы, г.

Содержание остаточных количеств имазалила в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2 параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор имазалила 2 мкг/см³, разбавляют ацетоном.

10. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

 где                                                 (1)

Х₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (r = 2,8σ_r).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

11. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

 где

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,02 мг/кг^*, где «^*» - 0,02 мг/кг - предел обнаружения имазалила в зерне гороха).

12. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

12.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

12.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

 где

 - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

Δ_л = ± 0,84Δ, где

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

 где

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

К_к = Х' - Х - С_д, где

X', X, С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

|К_к| ≤ К,                                                                 (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

12.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R):

 где                                                (3)

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

13. Разработчики

Долженко В.И., Цибульская И.А., Карпова Л.М. (ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений» Россельхозакадемии, Санкт-Петербург, Пушкин).