4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение концентраций действующих
веществ пестицидов в воде, почве, зеленой
массе, зерне и соломе зерновых культур,
семенах и масле рапса, зерне гороха,
семенах и масле льна

Сборник методических указаний
по методам контроля
МУК 4.1.3020-12; 4.1.3022-12;
4.1.3042-12; 4.1.3045-12

Москва 2013

1. Разработаны сотрудниками ГНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» Россельхозакадемии, ФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологии им. Д.И. Менделеева».

2. Введены в действие с момента утверждения.

3. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение остаточных количеств эсфенвалерата
в семенах и масле рапса
методом газожидкостной хроматографии

Свидетельство о метрологической аттестации от 24.02.2012 № 01.5.04.068/01.00043/2012.

Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в семенах рапса (горчицы) массовой концентрации эсфенвалерата в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг, в масле - 0,02 - 0,2 мг/кг.

Название действующего вещества по ИСО: эсфенвалерат.

Название действующего вещества по ИЮПАК: (S)-α'-циано-3-феноксибензил-(S)-2-(4-хлорфенил)-3-метилбутират.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: С₂₅Н₂₂ClNO₃.

Молекулярная масса: 419,9.

Химически чистый препарат - бесцветное кристаллическое вещество (до 23 °С).

Температура плавления: 59,0 - 60,2 °С.

Давление паров при 25 °С - 2 ∙ 10^-4 mPa.

Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_ow log P = 6,22 (25 °С).

Растворимость: в воде при 25 °С - 0,002 мг/л; в н-гексане - 10 - 50; метаноле - 70 - 100; в ксилоле, ацетоне, хлороформе, этилацетате, DMSO, DMFA - > 600 (в г/кг при 25 °С).

Вещество относительно стабильно на свету, стабильно к гидролизу при рН 5,7 и 9 (25 °С).

Краткая токсикологическая характеристика

Класс токсичности по ВОЗ - II, ЕПА - II.

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс 75 - 88 мг/кг.

Область применения

Инсектицид широкого спектра действия (группа пиретроидов), применяется на зерновых, масличных, плодовых и других культурах.

1. Погрешность измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений с погрешностью, не превышающей ± 25 %, при доверительной вероятности 0,95.

Метрологическая характеристика метода представлена в табл. 1 и 2.

Таблица 1

Метрологические параметры

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20, Р = 0,95) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Полнота определения эсфенвалерата в семенах и масле рапса (N = 5 для каждой концентрации)

2. Метод измерений

Методика основана на извлечении эсфенвалерата из семян и масла рапса (горчицы) водно-ацетоновым раствором или ацетонитрилом с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися жидкостями и на колонке с флорисилом. Количественное определение проводят методом газожидкостной хроматографии с использованием электронозахватного детектора.

Нижний предел измерения эсфенвалерата в пробе семян 0,01 мг/кг, масла - 0,02 мг/кг, средняя полнота извлечения из семян 82,4 % и из масла 77,4 %.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Примечание. Допускается применение оборудования иных производителей с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.007-76).

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-2009 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 мПа (150 кгс/см²) необходимо соблюдать «Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздуховодов и газопроводов под давлением» ПБ 03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

5. Отбор и хранение проб

Отбор проб семян и масла рапса (горчицы) - ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб».

Для длительного хранения семена рапса (горчицы) подсушивают при комнатной температуре в отсутствие света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы семян доводят до стандартной влажности и измельчают. Пробы масла рапса хранят в холодильнике при 0 - 4 °С в закрытой стеклянной таре не более 2 месяцев.

6. Подготовка к определению

6.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С до объема 1,0 см³ и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

6.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку, заполненную хроматоном N-Super (0,125 - 0,160 мм) с 5 % SE-30, не присоединяя к детектору, кондиционируют в токе инертного газа (азот) при температуре 250 °С в течение 8 - 10 ч.

6.3. Приготовление стандартного и градуировочных растворов

Берут точную навеску эсфенвалерата (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 см³, растворяют навеску в ацетоне и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/см³). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя для разбавления гексан. Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 6 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.

Для внесения в образец при определении полноты извлечения используют градуировочные растворы.

6.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация эсфенвалерата в растворе) в хроматограф вводят по 1 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют высоты или площади пиков и строят график зависимости среднего значения высоты (площади) пика от концентрации эсфенвалерата в градуировочном растворе (мкг/см³).

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

С = KS, где

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

 где

С - аттестованное значение массовой концентрации эсфенвалерата в градуировочном растворе;

С_к - результат контрольного измерения массовой концентрации эсфенвалерата в градуировочном растворе;

λ_контр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, % (λ_контр. = 10 % при P = 0,95).

6.5. Подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты и вносят суспензию 4,5 г флорисила в 20 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему), дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку промывают 25 см³ этой же смеси со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

6.6. Проверка хроматографического поведения эсфенвалерата на колонке с флорисилом

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 0,5 см³ стандартного раствора эсфенвалерата с концентрацией 1 мкг/см³. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 2 см³ элюента № 1 и вносят в колонку. Колбу обмывают еще 2 см³ элюента № 1 и также вносят в колонку. Затем промывают колонку 25 см³ гексана и элюируют эсфенвалерат 60 см³ элюента № 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 см³ каждая, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 см³ гексана и анализируют на содержание эсфенвалерата по п. 2.6.4. Фракции, содержащие эсфенвалерат, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 см³ гексана и анализируют по п. 2.6.4. Рассчитывают содержание эсфенвалерата в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание. Профиль вымывания эсфенвалерата может меняться при использовании новой партии сорбента.

6.7. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

7. Проведение определения

7.1. Экстракция эсфенвалерата из семян рапса

Навеску измельченных на лабораторной мельнице семян массой 10 г помещают в коническую колбу на 250 см³, заливают 50 - 100 см³ смеси растворителей ацетон-вода (в соотношении 1:1) и экстрагируют эсфенвалерат в ультразвуковой ванне в течение 15 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр («красная лента»). Экстракцию повторяют дважды 30 см³ той же смеси. Объединенный фильтрат помещают в делительную воронку и переэкстрагируют эсфенвалерат гексаном трижды порциями по 30 см³. Объединенные гексановые экстракты фильтруют через слой безводного сернокислого натрия. Полученный раствор выпаривают на ротационном испарителе при температуре бани 50 °С до полного удаления гексана. Далее проводят очистку экстрактов по п. 7.3.

7.2. Экстракция эсфенвалерата из рапсового масла

Навеску масла 10 г растворяют в 60 см³ гексана и экстрагируют эсфенвалерат 50 см³ ацетонитрила в УЗ-ванне в течение 15 мин. Полученную смесь помещают в делительную воронку объемом 250 см³. После расслоения^* нижний ацетонитрильный слой сливают, из верхнего гексанового слоя экстрагируют эсфенвалерат ацетонитрилом еще дважды порциями по 30 см³. К объединенному ацетонитрильному экстракту добавляют воду в соотношении ацетонитрил-вода (1:4) и переэкстрагируют эсфенвалерат хлороформом трижды порциями по 30 см³. Объединенные хлороформные экстракты сушат над безводным серно-кислым натрием и выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 50 °С. Сухой остаток растворяют в 5 см³ ацетона и помещают в морозильную камеру с температурой -18 °С на 2 ч. Охлажденный ацетоновый раствор декантируют в круглодонную колбу на 10 см³ через фильтр «красная лента», после чего фильтр промывают 2 см³ ацетона. Полученный раствор упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Далее очистку проводят по п. 7.3.

______________

^* В случае образования сравнительно стойких эмульсий можно добавить несколько мл насыщенного раствора хлористого натрия или этилового спирта.

7.3. Очистка экстрактов на колонке с флорисилом

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по пп. 7.1 и 7.2 экстрактов семян или масла, количественно переносят двумя порциями по 2 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 6.2). Промывают колонку 25 см³ гексана, элюат отбрасывают. Эсфенвалерат элюируют 60 см³ элюента № 2 (гексан-этилацетат = 2:8). Весь элюат собирают в грушевидную колбу емкостью 100 см³. Раствор выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 50 °С. Сухой остаток растворяют в 1 - 2 см³ гексана и 1 мм³ раствора вводят в хроматограф.

7.4. Условия хроматографирования

Газовый хроматограф «Цвет-550М» с ДПР (ДЭЗ).

Колонка стеклянная 1 м×3 мм, заполненная хроматоном N-Super (0,125 - 0,160 мм) с 5 % SE-30.

Температура колонки 240 °С, испарителя 250 °С, детектора 320 °С.

Скорость газа-носителя (азот) через колонку 46 см³/мин.

Шкала электрометра 8 ∙ 10¹⁰ (16 ∙ 10¹⁰).

Объем вводимой пробы 1 мкл.

Время удерживания эсфенвалерата 3 мин 20 с.

Линейный диапазон детектирования 0,1 - 2 нг.

7.5. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание эсфенвалерата в образце семян или масла (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

 где

Н₁ - высота (площадь) пика эсфенвалерата в стандартном растворе, мм (мв ∙ с);

Н₂ - высота (площадь) пика эсфенвалерата в анализируемой пробе, мм (мв ∙ с);

V - объём экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г;

С - концентрация эсфенвалерата в стандартном растворе, мкг/см³.

Содержание остаточных количеств эсфенвалерата в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2 параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор эсфенвалерата 2 мкг/см³, разбавляют.

8. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

 где                                                      (1)

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (r = 2,8σ_r).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

9. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(X ± Д) мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

 где

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,01 мг/кг^*, где «^*» - 0,01 мг/кг - предел обнаружения в семенах рапса).

10. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

10.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

10.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

 где

 - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

Δ_л = ±0,84Δ, где

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

 где

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

К_к = Х' - Х - С_д, где

X', X, С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

                                                      (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

10.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R):

 где                                                    (3)

X₁, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

11. Требования к квалификации оператора

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 10.

12. Разработчики

Цибульская И.А., Копытова Ф.И., Долженко О.В. (ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений» Россельхозакадемии (ГНУ ВИЗР), Санкт-Петербург, Пушкин).