4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение концентраций действующих
веществ пестицидов в воде, почве, зелёной
массе, зерне и соломе зерновых культур,
ботве и корнеплодах свеклы

Сборник методических указаний
по методам контроля

МУК 4.1.3021-12; 4.1.3043-12

Москва 2013

1. Разработаны сотрудниками ГНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» Россельхозакадемии.

2. Введены в действие с момента утверждения.

3. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение массовой концентрации пропизахлора
в ботве и корнеплодах свеклы методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.084/01.00043/2012.

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации пропизохлора в ботве свеклы в диапазоне концентраций 0,1 - 1,0 мг/дм³ в корнеплодах свеклы в диапазоне концентраций 0,025 - 0,25 мг/дм³.

Название действующего вещества по номенклатуре ICO: пропизахлор.

Название действующего вещества по номенклатуре IUPAC: 2-хлор-6¢-этил-N-изопропоксиметилацето-о-толуидин.

Структурная формула:

Брутто формула: C₁₅H₂₂ClNO₂.

Молекулярная масса: 283,8.

Химически чистое вещество представляет собой маслянистую жидкость от светло-коричневого до пурпурного цвета с характерным запахом.

Температура плавления: 21,6 °С.

Давление пара при 20 °С: 4 мПа.

K_owlogP = 3,50 (20 °C).

Растворимость в воде - 184 мг/дм³. Растворим в большинстве органических растворителей. Гидролитически стабилен. Через 5 дней хранения при 50 °С (рН 4, 7, 9) степень разложения составляет менее 10 %.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая оральная токсичность LD₅₀ для крыс 3433 мг/кг (мужские особи) и 2088 мг/кг (женские особи).

Дермальная токсичность LD₅₀ превышает 2000 мг/кг.

Ингаляционная токсичность LC₅₀ - 5000 мг/м³ для животных обоих полов (крысы).

Область применения препарата

Селективный гербицид для регулирования роста однолетних трав и некоторых широколистных сорняков на посевах кукурузы, подсолнечника, сои, картофеля и гороха.

Механизм действия заключается в ингибировании деления клеток посредством блокирования белкового синтеза при адсорбции гербицида на корнях прорастающих растений.

В России для пропизахлора в свекле гигиенические нормативы не установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Таблица 2

Полнота извлечения пропизахлора, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, Р = 0,95

2. Метод измерений

Методика основана на определении пропизохлора методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов с помощью «Набора для пробоподготовки по методу QuEChERS Interlab VetexQ для обычных овощей, фруктов и зерна (кат. № IL-5056)».

Идентификация пропизохлора проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования иных производителей с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

· процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

· выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Acquity ВЕН С18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Приготовление растворов

7.2.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 ± 0,01) г 98 %-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 55:45 по объёму, используя мерные цилиндры.

7.3. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску пропизохлора (50 ± 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

Градуировочные растворы с концентрациями пропизохлора 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,0 и 2,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 55: 45).

7.3.2. Раствор № 1 с концентрацией 2,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 4 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.3.3. Раствор № 2 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор № 3 с концентрацией 0,8 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 4 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5. Раствор № 4 с концентрацией 0,4 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.6. Раствор № 5 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.7. Раствор № 6 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения пропизохлора в ботве и корнеплодах сахарной свеклы используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация пропизохлора в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации пропиконазола в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

С = KS, где

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

 где

С - аттестованное значение массовой концентрации пропизахлора в градуировочном растворе;

С_к - результат контрольного измерения массовой концентрации пропизахлора в градуировочном растворе;

l_контр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, % (l_контр. = 10 % при Р = 0,95).

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб свеклы производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (от 21.08.79 № 2051-79), а также в соответствии с ГОСТ 1722-85 «Свекла столовая свежая, заготовляемая и поставляемая». Для длительного хранения аналитические пробы свеклы (ботва и корнеплоды) помещают в морозильную камеру с температурой -18 °С и хранят в закрытой полиэтиленовой таре.

9. Проведение определения

9.1. Определение пропизохлора в ботве и корнеплодах свеклы

В полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³ помещают (10 ± 0,1) г измельченной пробы (ботвы или корнеплодов), добавляют 10 см³ ацетонитрила и содержимое влагонепроницаемого пакета из «Набора для пробоподготовки по методу QuEChERS Interlab VetexQ для обычных овощей, фруктов и зерна (4 г MgSО₄ + 1 г NaCl)». Пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате в течение 15 мин, центрифугируют при скорости 4000 об./мин в течение 10 мин. Отбирают 5 см³ верхнего ацетонитрильного слоя и переносят в полипропиленовую центрифужную пробирку из набора вместимостью 15 см³, содержащую сорбент (150 мг PSA^* + 900 мг MgSO₄). Добавляют 50 мг активированного угля, пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате в течение 15 мин, центрифугируют при скорости 4000 об./мин в течение 10 мин. Аликвоту 2 см³ переносят в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в подвижной фазе (корнеплоды в 0,5 см³, ботву в 1,0 см³) и 10 мм³ вводят в хроматограф.

______________

^* Смесь первичных и вторичных аминов.

Альтернативный вариант пробоподготовки

В полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³ помещают (10 ± 0,1) г измельченной пробы (ботвы или корнеплодов), прибавляют 10 см³ ацетонитрила, 0,1 см³ ледяной уксусной кислоты, 8 г семиводного магния сернокислого и 1 г натрия уксусно-кислого. Пробирку плотно закрывают крышкой, встряхивают на аппарате в течение 15 мин и центрифугируют при скорости 4000 об./мин в течение 10 мин. Отбирают 5 см³ верхнего ацетонитрильного слоя и переносят его в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 15 см³, содержащую 250 мг силикагеля, 750 мг безводного магния сернокислого и 50 мг активированного угля. Пробирку плотно закрывают крышкой, встряхивают на аппарате 10 мин и центрифугируют при скорости 4000 об./мин в течение 10 мин. Аликвоту 2 см³ переносят в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в подвижной фазе (корнеплоды в 0,5 см³, ботву в 1,0 см³) и 10 мм вводят в хроматограф.

9.2. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC ВЕН С18 (2,1´100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки (30 ± 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 55:45 (по объему). Скорость потока элюента 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 220 нм. Объем вводимой пробы 10 мм³. Время удерживания пропизахлора (6,8 ± 0,1) мин.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание пропизохлора в ботве и корнеплодах сахарной свеклы (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

 где

S_x - площадь пика пропизохлора на хроматограмме испытуемого образца, мм² (AU);

К - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г;

k = 5 - коэффициент, учитывающий объем аликвоты экстракта, взятый для анализа;

f - полнота извлечения пропизохлора, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств пропизохлора в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор пропизохлора с концентрацией 2,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости;

 где                                            (1)

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (r = 2,8s_r).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

D - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

 где

d - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,025 мг/кг^*, где «^*» - 0,025 мг/кг - предел обнаружения пропизохлора в корнеплодах свеклы).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

 где

, () - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:

D_л = ±0,84D, где

D - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

 где

d - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

К_к = Х¢ - Х - С_д, где:

X¢, X, С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

                                                       (1)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

                                                               (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

 где                                              (3)

X₁, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

14. Разработчики

Долженко В.И., Цибульская И.А., Черменская Т.Д., Комарова А.С. (ГНУ Всероссийского НИИ защиты растений Россельхозакадемии).