4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение концентраций действующих
веществ пестицидов в воде, почве, зелёной
массе, зерне и соломе зерновых культур,
ботве и корнеплодах свеклы

Сборник методических указаний
по методам контроля

МУК 4.1.3021-12; 4.1.3043-12

Москва 2013

1. Разработаны сотрудниками ГНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» Россельхозакадемии.

2. Введены в действие с момента утверждения.

3. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение концентраций флуксапироксада в воде,
почве, зелёной массе, зерне и соломе зерновых культур
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания

Свидетельство о метрологической аттестации от 11.10.2011 № 01.5.04.035/01.00043/2011.

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации флуксапироксада в воде - в диапазоне концентраций 0,001 - 0,005 мг/дм³, в почве и зерне - в диапазоне концентраций 0,005 - 0,05 мг/кг, в зеленой массе - 0,02 - 0,1 мг/кг, соломе - 0,05 - 0,25 мг/кг.

Название действующего вещества по номенклатуре ICO: флуксапироксад.

Название действующего вещества по номенклатуре IUPAC: ( ± )3-(дифторметил)-1-метил-М(3¢,4¢,5¢-трифтор[1,1¢-бифенил]-2-ил)-1Н-пиразол-4-карбоксамид.

Структурная формула:

Брутто формула: C₁₈H₁₂F₅N₃O.

Молекулярная масса: 381.

Химически чистое вещество представляет собой кристаллический порошок бежевого цвета без запаха.

Температура плавления: > 157 °С.

Давление пара 1,1×10^-7 мРа.

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода К_owlgP > 3,0 (20 °С).

Растворимость в воде (мг/дм³, 20 °С): 3,88.

Растворимость в органических растворителях (г/дм³, 20 °С): ацетон ® 250; ацетонитрил, дихлорметан, этилацетат ® 100; метанол - 53,4; толуол - 20,0.

Гидролитически стабилен в водных растворах при рН 4 - 9.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная - ЛД₅₀ > 2000 мг/кг массы тела. Острая кожная - ЛД₅₀ > 2000 мг/кг массы тела. Острая ингаляционная - ЛК₅₀ (4 ч) > 5,1 мг/л. Раздражающее действие - кролики: кожа - не раздражает; глаза - не раздражает.

Сенсибилизация - не обладает.

Область применения

Фунгицид для обработки вегетирующих растений против комплекса болезней зерновых культур.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Таблица 2

Полнота извлечения флуксапироксада, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для п = 20, Р = 0,95

2. Метод измерений

Методика основана на: определении флуксапироксада методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его твердофазной экстракции из воды или жидкостной экстракции из образцов почвы, зеленой массы и соломы ацетонитрилом в присутствии ацетатного буфера, насыщенного сульфатом магния, и обеспечивающего разделение водной и органической фаз; очистке ацетонитрильного экстракта с помощью дисперсионной твердофазной экстракции при одновременном удалении воды безводным сульфатом магния. При анализе зерна используют «Набор для пробоподготовки по методу QuEChERS Interlab VetexQ для обычных овощей, фруктов и зерна (кат. № IL-5056)» с дополнительной очисткой на патронах с силикагелем.

Идентификация флуксапироксада проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования иных производителей с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Acquity ВЕН С18 и Acquity Shield RP18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Приготовление растворов

7.2.1. Раствор 0,005 М ортофосфорной кислоты: (0,5 ± 0,01) г 98 %-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50 по объёму, используя мерные цилиндры.

7.2.3. Приготовление элюента № 1: в колбе на 100 см³ смешивают 80 см³ н-гексана и 20 см³ этилацетата, используя мерные цилиндры.

7.2.4. Приготовление элюента № 2: в колбе на 100 см³ смешивают 50 см³ н-гексана и 50 см³ этилацетата, используя мерные цилиндры.

7.3. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску флуксапироксада (50 ± 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.3.2. Приготовление градуировочных растворов (анализ на колонке Acquity ВЕН С18).

Градуировочные растворы с концентрациями флуксапироксада 0,02; 0,04; 0,06; 0,08 и 0,1 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50).

7.3.2.1. Раствор № 1 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 1 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой (5 мкг/см³). В другую мерную колбу вместимостью 100 см³ переносят 2,0 см³ полученного раствора. Объем вновь доводят до метки подвижной фазой (0,1 мкг/см³).

7.3.2.2. Раствор № 2 с концентрацией 0,08 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 8,0 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.2.3. Раствор № 3 с концентрацией 0,06 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 6 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.2.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,04 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 4 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.2.5. Раствор № 5 с концентрацией 0,02 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.3. Приготовление градуировочных растворов (анализ на колонке Acquity Shield RP18).

Градуировочные растворы с концентрациями флуксапироксада 0,01, 0,02, 0,05, 0,1 и 0,2 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50).

7.3.3.1. Раствор № 1 с концентрацией 5,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 1 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.3.3.2. Раствор № 2 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 4,0 см³ раствора № 1 и доводят до метки подвижной фазой.

7.3.3.3. Раствор № 3 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 2,0 см³ раствора № 1 и доводят до метки подвижной фазой.

7.3.3.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,05 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5 см³ раствора № 3 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.3.5. Раствор № 5 с концентрацией 0,02 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2 см³ раствора № 3 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.3.6. Раствор № 6 с концентрацией 0,01 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора № 3 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения флуксапироксада в воде, почве, зерне, зеленой массе и соломе зерновых культур используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.4. Построение градуировочного графика

Дня установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация флуксапироксада в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации флуксапироксада в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

C = KS, где

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

 где

С - аттестованное значение массовой концентрации флуксапироксада в градуировочном растворе;

С_к - результат контрольного измерения массовой концентрации флуксапироксада в градуировочном растворе;

l_контр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, % (l_контр. = 10 % при Р = 0,95).

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (от 21.08.79 № 2051-79), а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб»; ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) «Зерновые. Отбор проб зерна»; ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб». Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, зерно и солому измельчают на лабораторных мельницах.

9. Проведение определения

9.1. Определение флуксапироксада в воде

Через патрон Диапак С16 пропускают 50 см³ воды. Фильтрат отбрасывают. Флуксапироксад элюируют 3 см³ ацетона. Элюат упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2,5 см³ подвижной фазы. 10 мм³ полученного раствора вводят в хроматограф.

9.2. Определение флуксапироксада в зеленой массе и соломе зерновых культур

В полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³ помещают 10 г измельченной зеленой массы или 4 г соломы, прибавляют 10 см³ воды, 10 см³ ацетонитрила, 0,1 см³ ледяной уксусной кислоты, 4 г безводного магния серно-кислого и 1 г натрия уксусно-кислого. Пробирку плотно закрывают пробкой, встряхивают на аппарате в течение 15 мин и центрифугируют при скорости 8000 об./мин в течение 10 мин. Супернатант декантируют и количественно переносят в другую тефлоновую центрифужную пробирку. Если супернатант декантировать не удается, то массу фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр «красная лента». Измеряют объем супернатанта или фильтрата и прибавляют к нему силикагель и безводный магний серно-кислый из расчета 50 мг силикагеля, 150 мг магния серно-кислого на 1 см³ супернатанта. При работе с образцами зеленой массы или соломы к супернатанту также прибавляют активированный уголь из расчета 7,5 мг на 1 см³ супернатанта. Пробирку плотно закрывают пробкой, встряхивают на аппарате 15 мин и центрифугируют при скорости 8000 об./мин в течение 10 мин. Количественно отбирают с помощью шприца верхний ацетонитрильный слой, переносят его в мерную колбу вместимостью 10 см³ и доводят объем до метки водой. 10 мм³ полученного раствора вводят в хроматограф.

9.3. Определение флуксапироксада в почве

В полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³ помещают 10 г просеянной почвы, прибавляют 3 см³ воды для смачивания пробы, через 2 мин прибавляют 10 см³ воды, 10 см³ ацетонитрила, 0,1 см³ ледяной уксусной кислоты, 4 г безводного магния серно-кислого и 1 г натрия уксусно-кислого. Пробирку плотно закрывают крышкой, встряхивают на аппарате в течение 15 мин и центрифугируют при скорости 4000 об./мин в течение 10 мин. Отбирают 5 см³ верхнего ацетонитрильного слоя и переносят его в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 15 см³, содержащую 250 мг силикагеля и 750 мг безводного магния серно-кислого. Пробирку плотно закрывают крышкой, встряхивают на аппарате 10 мин и центрифугируют при скорости 4000 об./мин в течение 10 мин. Аликвоту 2 см³ переносят в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток очищают на патроне Диапак С.

9.4. Определение флуксапироксада в зерне

В полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³ помещают 10 г измельченного зерна, добавляют 15 см³ воды, 10 см³ ацетонитрила и содержимое влагонепроницаемого пакета из «Набора для пробоподготовки по методу QuEChERS Interlab VetexQ для обычных овощей, фруктов и зерна (кат. № IL-5056)». Пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате в течение 15 мин, центрифугируют при скорости 4000 об./мин в течение 10 мин. Отбирают 5 см³ верхнего ацетонитрильного слоя и переносят в полипропиленовую центрифужную пробирку из набора вместимостью 15 см³, содержащую сорбент. Пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате в течение 15 мин, центрифугируют при скорости 4000 об./мин в течение 10 мин. Аликвоту 2 см³ переносят в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток очищают на патроне Диапак С.

9.5. Очистка на патроне Диапак С

9.5.1. Кондиционирование патрона Диапак С

Патрон с силикагелем Диапак С промывают 2 см³ элюента № 2, затем 3 см³ гексана.

9.5.2. Дополнительная очистка проб почвы и зерна на патронах Диапак С

Сухой остаток, полученный по пп. 9.4 или 9.5 растворяют в 1 см³ гексана, наносят на предварительно кондиционированный патрон, колбу ополаскивают 1 см³ гексана и так же наносят на патрон. Патрон промывают 6 см³ элюента № 1, элюат отбрасывают. Флуксапироксад элюируют 3 см³ смеси № 2, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и 10 мм³ вводят в хроматограф.

9.6. Условия хроматографирования

9.6.1. Условия анализа проб воды, зеленой массы и соломы

Ультраэффективный жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC ВЕН С18 (2,1´100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки (30 ± 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50. Скорость потока элюента: 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 230 нм. Объем вводимой пробы 10 мм³. Время удерживания флуксапироксада (4,8 ± 0,1) мин.

9.6.2. Условия анализа проб почвы и зерна

Ультраэффективный жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY SHIELD RP 18 (2,1´100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки (30 ± 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50. Скорость потока элюента: 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 230 нм. Объем вводимой пробы 10 мм³. Время удерживания флуксапироксада (5,0 ± 0,1) мин.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале концентраций (0,01 - 0,2) мкг/см³.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание флуксапироксада в воде, почве, зеленой массе, зерне и соломе зерновых (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

 где

S_x - площадь пика флуксапироксада на хроматограмме испытуемого образца, мм² (AU);

К - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г;

F - полнота извлечения флуксапироксада, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств флуксапироксада в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор флуксапироксада с концентрацией 0,2 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

 где                                                  (1)

X₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (r = 2,8s_r).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

D - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

 где

d - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,005 мг/кг^*, где «^*» - 0,005 мг/кг - предел обнаружения флуксапироксада в почве и зерне зерновых).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

 где

, () - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

D_л = ± 0,84D, где

D - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

 где

d - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

                                                               (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R):

 где                                              (3)

X₁, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

14. Разработчики

Долженко В.И., Цибульская И.А., Журкович И.К., Черменская Т.Д., Комарова А.С. (ГНУ Всероссийский НИИ защиты растений Россельхозакадемии).