4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
прогексадиона-кальция в зерне и соломе
зерновых культур методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.3234-14

Москва 2015

1. Разработаны сотрудниками ФБГНУ Всероссийский НИИ защиты растений Федерального агентства научных организаций, Санкт-Петербург, Пушкин (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, А.О. Берестецкий, Е.В. Полуэктова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 ноября 2014 г. № 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия населения, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 22 декабря 2014 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
прогексадиона-кальция в зерне и соломе
зерновых культур методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.181/01.00043/2014.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации прогексадиона-кальция в зерне зерновых культур в диапазоне концентраций 0,025 - 0,5 мг/кг, в соломе 0,25 - 2,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Прогексадион-кальция.

Структурная формула:

Кальций 3-оксидо-5-оксо-4-пропионилциклогекса-3-енкарбоксилат (IUPAC).

Молекулярная масса: 250,3.

Брутто формула: C₁₀H₁₀CaO₅.

Химически чистое вещество представляет собой мелкодисперсный белый порошок без запаха.

Температура плавления > 360 °С.

Давление пара 1,33×10^-2 мРа (20 °С).

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода Kow log Р = -2,90.

Растворимость в воде (мг/дм³, 20 °С): 174.

Растворимость в органических растворителях (мг/дм³, 20 °С): метанол - 1,11; ацетон - 0,038.

Стабилен в водных растворах (ДТ₅₀ составляет 5 дней при pH 5,0 и температуре 20 °С и 83 дня при pH 9,0). Устойчив к нагреванию до 200 °С и воздействию солнечного света. рКа 5,15.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая оральная токсичность для крыс и мышей > 5000 мг/кг. При подкожном введении крысам LД₅₀ > 2000 мг/кг. Оказывает слабое раздражающее действие на глаза, но не раздражает кожу (кролики). Ингаляционная токсичность для крыс LС₅₀ составляет 4,21 мг на 1 литр воздуха.

Область применения. Регулятор роста растений. Используется в качестве средства от полегания мелкозерновых злаков. Также может быть использован как замедлитель роста дерна, земляных орехов и цветов или для ингибирования удлинения новых побегов фруктовых деревьев.

В России для прогексадиона-кальция установлены гигиенические нормативы для плодовых семечковых культур - МДУ 0,5 мг/кг.

1. Метрологическая характеристика метода

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

________

^*) соответствует расширенной неопределенности U_отн. при коэффициенте охвата к = 2.

Таблица 2

Полнота извлечения прогексадиона, стандартное отклонение,
доверительный интервал среднего результата для n = 20, P = 0,95

2. Метод измерения

Методика основана на определении прогексадиона-кальция по свободной кислоте прогексадиону методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем с последующей очисткой экстрактов на концентрирующих патронах для твердофазной экстракции, заполненных ионобменной смолой.

Идентификация прогексадиона проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки. Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные
устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками необходимо соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны».

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом работы аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,3 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Приготовление растворов

7.2.1. Приготовление 0,005 М раствора ортофосфорной кислоты: в мерную колбу вместимостью 1 дм³ помещают 200 см³ воды для лабораторного анализа, прибавляют 0,5 г 98 %-й ортофосфорной кислоты и доводят объем до метки водой.

7.2.2. Приготовление подвижной фазы: в мерную колбу вместимостью 1 дм³ помещают 250 см³ ацетонитрила и доводят объем до метки раствором 0,005 М ортофосфорной кислоты.

7.2.3. Приготовление 2,5 М раствора серной кислоты.

В мерную колбу объёмом 1 дм³ добавляют 800 см³ бидистиллированной воды, 141,24 см³ серной кислоты и доводят до метки бидистиллированной водой.

7.2.4. Экстракционная смесь.

В мерную колбу объёмом 1 дм³ помещают 990 см³ ацетонитрила и добавляют 10 см³ 2,5 М раствора серной кислоты.

7.2.5. Приготовление 5 %-го раствора фосфорно-кислого натрия.

В мерную колбу объёмом 1 дм³ помещают 50 г натрия фосфорнокислого 1-замещенного 2-водного, растворяют при перемешивании в 600 см³ дистиллированной воды и доводят объём раствора до метки.

7.2.6. Приготовление 10 М раствора ортофосфорной кислоты.

В мерную колбу объёмом 200 см³ добавляют 95,18 см³ бидистиллированной воды, затем осторожно добавляют 104,82 см³ концентрированной ортофосфорной кислоты.

7.2.7. Приготовление насыщенного раствора хлорида натрия.

В мерную колбу объёмом 1 дм³ помещают 320 г кристаллического хлористого натрия, растворяют при перемешивании в 600 см³ бидистиллированной воды и доводят объём раствора до метки.

7.2.8. Приготовление 0,1 н раствора гидроксида натрия.

В мерную колбу объёмом 1 дм³ помещают 4 г кристаллического гидроксида натрия и растворяют при перемешивании в 800 см³ бидистиллированной воды, доводя объём раствора до метки.

7.2.9. Приготовление элюента № 1 (метанол - 0,1 н гидроксид натрия в соотношении 20:80).

В мерной колбе объёмом 100 см³ смешивают 20 см³ метанола и 80 см³ 0,1 н раствора гидроксида натрия. Полученную смесь перемешивают.

7.2.10. Приготовление элюента № 2 (1 %-й водный раствор муравьиной кислоты).

В мерную колбу объёмом 1 дм³ помещают 990 см³ бидистиллированной воды и добавляют 10 см³ муравьиной кислоты при перемешивании.

7.2.11. Приготовление 50 %-го раствора метанола.

В мерную колбу объёмом 100 см³ вносят 50 см³ метанола и доводят до метки бидистиллированной водой, полученную смесь перемешивают.

7.2.12. Приготовление элюента № 3 (1 %-й раствор муравьиной кислоты в 50 %-ом метаноле).

В мерную колбу объёмом 100 см³ помещают 99 см³ смеси метанол-вода в соотношении 50:50 по объёму и добавляют 1 см³ муравьиной кислоты.

7.2.13. Приготовление элюента № 4 (1 %-й раствор муравьиной кислоты в метаноле).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ добавляют 99 см³ метанола и при перемешивании добавляют 1 см³ муравьиной кислоты.

7.3. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,1 мг/см³: точную навеску прогексадиона (10 ± 0,1 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы с концентрациями 0,125, 0,25, 0,5, 1,0 и 2,5 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы.

7.3.2. Раствор № 1 с концентрацией 2,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 2,5 см³ основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.3. Раствор № 2 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 1,0 см³ основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор № 3 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора № 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5. Раствор № 4 с концентрацией 0,25 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора № 3 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.6. Раствор № 5 с концентрацией 0,125 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора № 4 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 4 недель, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения для внесения в матрицу используют ацетонитрильные растворы прогексадиона с концентрациями 1,0 и 10,0 мкг/см³, которые готовят из основного стандартного раствора (п. 7.3.1) с концентрацией 0,1 мг/см³ методом последовательного разбавления ацетонитрилом.

7.4. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика -концентрация прогексадиона в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации прогексадиона в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

С - аттестованное значение массовой концентрации прогексадиона в градуировочном растворе,

С_K - результат контрольного измерения массовой концентрации прогексадиона в градуировочном растворе,

λ_контр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, %. (λ_контр. = 10 % при Р = 0,95).

7.5. Подготовка анионообменных патронов
для твердофазной экстракции

Патрон промывают 10 см³ 1 %-го раствора муравьиной кислоты в метаноле и подсушивают током воздуха. Затем патроны последовательно промывают 5 см³ метанола и 5 см³ воды. Нельзя допускать высыхания верхнего слоя сорбента.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) «Зерновые. Отбор проб зерна». Пробы зерна и соломы для определения остатков прогексадиона в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Перед анализом пробы зерна доводят до стандартной влажности и измельчают.

9. Проведение определения

9.1. Экстракция

Образец измельчённого зерна массой (5 ± 0,1) г или соломы массой (1 ± 0,1) г помещают в центрифужные пробирки вместимостью 50 см³, добавляют 35 см³ экстракционной смеси, приготовленной по п. 7.2.4, интенсивно перемешивают в течение 10 мин и центрифугируют при 4 000 об./мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость декантируют и переносят в испарительную колбу объемом 250 см³. Экстракцию повторяют дважды с 35 и 30 см³ смеси, после чего объединённый экстракт упаривают на роторном испарителе при температуре бани не выше 45 °С до объёма 10 см³.

К полученному экстракту добавляют 50 см³ 5 %-го раствора дигидрофосфата натрия и переносят в делительную воронку. Испарительную колбу обмывают 50 см³ новой порции 5 %-го раствора дигидрофосфата натрия и переносят в ту же делительную воронку. Затем в нее добавляют 50 см³ н-гексана и встряхивают несколько минут. Водный слой отделяют (органический - отбрасывают) и доводят до pH 3 с помощью 10 М ортофосфорной кислоты, после чего добавляют 30 см³ насыщенного раствора хлорида натрия. Прогексадион переэкстрагируют дважды хлористым метиленом порциями по 50 см³, встряхивая делительную воронку в течение 2 - 3 мин. Органическую фазу фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г) в испарительную колбу объемом 250 см³, осушитель промывают 10 - 15 см³ хлористого метилена и вносят в ту же испарительную колбу. Полученный раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С.

9.2. Очистка на анионообменных патронах
для твердофазной экстракции

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов зерна или соломы, растворяют в 10 см³ 0,1 н раствора гидроксида натрия, помещая образцы в ультразвуковую ванну на 2 - 3 мин. Раствор вносят в кондиционированный анионообменный патрон со скоростью пропускания раствора 1 - 2 капли в секунду. После нанесения раствора патрон промывают 10 см³ 0,1 н раствора гидроксида натрия, элюат отбрасывают. Затем патрон промывают последовательно 10 см³ элюента № 1 и 10 см³ метанола, элюат отбрасывают. Патрон подсушивают током воздуха. После этого патрон последовательно промывают по 10 см³ элюентов № 2 и 3. Патрон подсушивают током воздуха, после чего прогексадион элюируют 10 см³ элюента № 4. Элюат упаривают на роторном испарителе при температуре не выше 45 °С. Сухой остаток растворяют в 2 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ (приготовленной по п. 7.2.2) и анализируют на содержание прогексадиона. 10 мм³ полученного раствора вводят в хроматограф.

9.3. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором. Элюирование в системе ацетонитрил - 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 25:75 по объему. Скорость потока 0,3 см³/мин. Дозируемый объем 10 мм³. Колонка, заполненная сорбентом с привитой фазой, включающей гидрофильную карбаматную группу в цепи С18, (100×2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки 40 °С. Детектирование на длине волны 275 нм. Время удерживания прогексадиона 2,65 ± 0,055 мин.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале концентраций 0,125 - 2,5 мкг/см³.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание прогексадиона-кальция в зерне (или соломе) X (мг/кг) вычисляют по формуле:

S_x - площадь пика прогексадиона на хроматограмме испытуемого образца, (AU-сек);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

Р - навеска (объем воды) анализируемого образца, г (см³);

f - полнота извлечения прогексадиона, приведенная в табл. 2,

F - фактор пересчета содержания прогексадиона в его кальциевую соль (250,3/212,2 = 1,18).

Содержание остаточных количеств прогексадиона-кальция в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор прогексадиона с концентрацией 2,5 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов
параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

X₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (r = 2,8σ_r).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,05 мг/кг*, где * - 0,05 мг/кг - предел обнаружения прогексадиона-кальция в зерне).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

±Δ_{л, Х} (±Δ_{л, Хʹ}) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

Хʹ, Х, С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.